田淑媛，王景峰，楊睿，郎鐵柱，楊秀文
（天津大學(xué)環(huán)境工程系，天津300072） 摘要：用氧化還原電位儀嚴(yán)格監(jiān)測反應(yīng)過程，準(zhǔn)確測定了在厭氧狀況下PHB的合成量與聚磷酸鹽的釋放量；對活性污泥細(xì)胞內(nèi)的PHB顆粒和聚磷顆粒進(jìn)行了大量染色及顯微鏡檢分析。通過試驗(yàn)證明，厭氧狀況發(fā)生了PHB大量合成與聚磷酸鹽大量釋放，并得出二者關(guān)系曲線圖，對其生化機(jī)理進(jìn)行了深入研究。
關(guān)鍵詞：生物除磷；PHB；質(zhì)子移動力；氧化還原電位；聚磷菌
中圖分類號：X501
文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A
文章編號：1000-4602(2000)07-0005-03 Relationship between PHB and Polyphosphate under Anaerobic Condition and Related Biochemical Mechanisms TIAN Shu yuan，WANG Jing feng，YANG Rui，LANG Tie zhu， YANG Xiu wen
(Depart of EnvironEng,Tianjin Univ,Tianjin 300072,China) Abstract：Oxidation reduction potential meter was used to monitor the whole reaction process in this research The quantity of Poly β hydroxybutyrate (PHB) synthetized and poly?phosphate released were accurately measured under the anaerobic condition The PHB in activated sludge cell and polyphosphate particles were dyed and examined with the microscope Large amount of PHB synthesized and polyphosphate released under anaerobic condition were testified through experiment, and a relationship curve between them was obtained Also the detail biochemistry mechanism was studied
Keywords:biological phosphorus removal; PHB;proton motive force; oxidation reduction potential; phosphate accumulating bacteria 基金項(xiàng)目：天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(983606511) 為經(jīng)濟(jì)有效地解決日益嚴(yán)重的磷污染問題，應(yīng)用生物除磷方法對厭氧狀況下污泥細(xì)胞內(nèi)PHB合成與生物磷釋放的關(guān)系及其生化機(jī)理進(jìn)行了深入的分析研究。 1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 1 1批量規(guī)模反應(yīng)的原水
從模擬改進(jìn)的UCT流程(見圖1)中培養(yǎng)馴化高效除磷活性污泥，然后從好氧區(qū)中取出12 L污水(其沉淀后的上清液體積與污泥體積比大約為2:1)分配到三個圓柱型有機(jī)玻璃反應(yīng)器中(每個反應(yīng)器中為4L污水)，加蓋攪拌一夜后測出三個反應(yīng)器中的氧化電位均在-100～-200 mV之間，表明污水在反應(yīng)器中處于嚴(yán)格的厭氧狀態(tài)而無NO3-等電子受體。 
1 2批量規(guī)模反應(yīng)的基質(zhì)濃度
?、? 第一批反應(yīng)：1號反應(yīng)器添加乙酸造成反應(yīng)器中乙酸濃度為200 mg/L；2號反應(yīng)器添加丙酸使其濃度為200 mg/L；3號反應(yīng)器添加丁酸使其濃度為200 mg/L。測定在厭氧狀況下，不同基質(zhì)對磷酸鹽釋放和PHB合成的影響。
?、?第二批反應(yīng)：在三個反應(yīng)器中添加乙酸，使其濃度分別為100、75、50 mg/L。測定厭氧狀況下凈磷酸鹽釋放量與乙酸基質(zhì)消耗量的關(guān)系。
1 3取樣方法及測定前的處理方法
在第1 h中20 min取樣一次，在2 h時(shí)取樣一次，每次取樣75 mL并立即分析。首先對樣品離心處理，將上清液保存于4 ℃的冰箱供待測PO43-濃度。沉淀污泥用2mL、濃度為6%的漂白粉溶液處理以停止污泥細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步的生物活性，并冷凍保存供測定PHB。 2 測定方法及所用儀器 2 1氧化還原電位
該指標(biāo)采用Fisher Accumlt pH儀測定。將所用電極用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液標(biāo)定:電極在pH＝7的緩沖液中讀數(shù)為86mV，在pH＝4的緩沖液中讀數(shù)為263mV。用此指標(biāo)可以嚴(yán)格監(jiān)控反應(yīng)的厭氧狀態(tài)。
2 2 PHB測定
首先將經(jīng)預(yù)處理的活性污泥放入離心機(jī)中在1000 r/min狀態(tài)下分離20min，倒掉上清液，將沉淀污泥冷凍，真空干燥一夜。然后用分析天平稱重并將此污泥用氯仿萃取，應(yīng)用Comlau(1988)和Mab(1990)方法，將2μL氯仿萃取液注入到氣液相色譜儀上，即可得到典型的污泥樣品色譜層析圖(圖2)。 
2.3 PO43-測定
用Lachat auikchlm自動流注射離子分析儀測定。 3 試驗(yàn)結(jié)果 (1).第一批批量試驗(yàn)結(jié)果見表1和圖3、4。其中PHA為聚β羥基鏈烷酸，PHV為聚β羥基戊酸，PHB為聚β羥基丁酸。 表1 厭氧條件下濃度均為200mg/L的不同短鏈脂肪酸基質(zhì)中PHA、PHV、PHB含量及磷釋放量 | 投加物質(zhì) | 編號 | 時(shí)間（min） | PHB（μg/mg) | PHV（μg/mg) | PHA（μg/mg) | 磷酸鹽（mg/L) | | 乙酸 | 1 | 0 | 2.3 | 4.5 | 6.8 | 31 | | 2 | 20 | 6.5 | 8.5 | 15 | 71 | | 3 | 40 | | | | 96 | | 4 | 60 | 11.5 | 11.5 | 23 | 98 | | 5 | 120 | 19.7 | 5.9 | 25.6 | 102 | | 丙酸 | 1 | 0 | 2.3 | 4.5 | 6.8 | 31 | | 2 | 20 | 2.9 | 6.9 | 9.6 | 59 | | 3 | 40 | 2.1 | 8.2 | 10.3 | 85 | | 4 | 60 | 2.4 | 12.3 | 14.7 | 91 | | 5 | 80 | 12.9 | 4.4 | 17.3 | 100 | | 丁酸 | 1 | 0 | 2.3 | 4.5 | 6.8 | 31 | | 2 | 20 | 4.2 | 6.5 | 8.8 | 54 | | 3 | 40 | 4.6 | 5.2 | 9.8 | 61 | | 4 | 60 | 5.1 | 5.8 | 11.0 | 68.8 | | 5 | 80 | 6.3 | 7.0 | 13.3 | 77 |
 
(2)第二批批量試驗(yàn)結(jié)果見圖5。從圖中可以看出，三種濃度的乙酸基質(zhì)均表現(xiàn)出其消耗量的大小與凈磷酸鹽的釋放量成正比關(guān)系，而且斜率均大致為05左右，相應(yīng)的分子比率是0.97:1.0(摩爾P:HAC)。 
(3)結(jié)合上述試驗(yàn)，對活性污泥樣品中PHB顆粒和聚磷酸鹽顆粒進(jìn)行大量染色，并將染色切片在光學(xué)顯微鏡(10×40倍)下觀察，可得到如下結(jié)論：在厭氧區(qū)(氧化還原電位在-100 mV以下)污泥細(xì)胞內(nèi)PHB顆粒迅速、大量地增加，聚磷酸鹽顆粒迅速減少；在好氧區(qū)污泥細(xì)胞內(nèi)PHB顆粒迅速減少，聚磷酸鹽顆粒迅速增加。 4 生物除磷生化機(jī)理分析 從細(xì)菌生物能學(xué)角度看，細(xì)菌質(zhì)子移動力(the proton motive force簡稱pmf)在釋磷和吸磷時(shí)，即磷在細(xì)胞內(nèi)外的轉(zhuǎn)移過程中起了決定性作用。pmf是細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)外的化學(xué)滲透濃度梯度，其主要作用是通過膜結(jié)合酶復(fù)合體合成ATP和用于運(yùn)輸基質(zhì)到細(xì)胞內(nèi)。而且，細(xì)菌具有維持pmf在某一恒定最佳值上的趨勢。厭氧過程中，聚磷的分解將引起細(xì)胞內(nèi)磷的積累，細(xì)胞內(nèi)不能用于合成作用的磷酸鹽將被PH敏感載體蛋白傳感。載體蛋白通過主動擴(kuò)散將過剩的磷排到胞外，同時(shí)，金屬陽離子也被協(xié)同運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，其宏觀現(xiàn)象就是液相中磷濃度升高。在厭氧狀態(tài)下，細(xì)菌儲存的多聚磷酸鹽水解，為ATP的產(chǎn)生提供所需的能量，并使細(xì)胞內(nèi)的乙酸活化產(chǎn)生乙酰輔酶A。一部分乙酰輔酶A可以轉(zhuǎn)化為PHB，PHB(poly-β-hydroxybutyrate)是β羥基丁酸聚合物的簡稱，是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)貯存能量的脂質(zhì)內(nèi)含物。在厭氧條件下，活性污泥聚磷菌細(xì)胞內(nèi)有大量PHB迅速合成。進(jìn)入好氧區(qū)后，聚磷菌消耗大量內(nèi)含物PHB顆粒和外源機(jī)質(zhì)，產(chǎn)生pmf。為了維持pmf的恒定，聚磷菌通過消耗pmf把胞外的磷以中性或電陽性的形式主動運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)合成ATP，合成聚磷酸鹽。在好氧狀態(tài)下，細(xì)菌儲存的PHB降解代謝為生物合成提供碳，并通過TCA循環(huán)(三羧酸循環(huán))產(chǎn)生ATP，為合成細(xì)胞物質(zhì)及細(xì)胞活動和聚磷酸鹽的大量合成提供能量。因而在好氧條件下，活性污泥聚磷菌細(xì)胞吸收磷使廢水中磷高效去除。
正如Dawes和Sensor(1973)所述，在儲存能量的過程中，PHB的合成十分獨(dú)特，因?yàn)橹灰ＷC乙酰輔酶A的來源，該過程不需要ATP的直接參與。但NADH的還原能力十分重要，而且PHB的形成過程被看成是一個類發(fā)酸過程，該過程允許NADH重新氧化成NAD+。當(dāng)缺氧條件通過電子傳輸鏈阻礙了NADH的重氧化時(shí)，這樣的過程尤為重要。在細(xì)菌體內(nèi)NAD+及CoA濃度很高而乙酰CoA濃度很低(如外界有機(jī)碳來源受限而有氧存在)時(shí)，PHB就會分解。
研究表明，在厭氧條件下，污泥菌膠團(tuán)的污泥磷大量消失，PHB大量增多。好氧條件下，大量吸收磷的同時(shí)PHB迅速減少，聚磷迅速增多。厭氧條件下合成的PHB越多，好氧條件下聚磷合成量越大。由于聚磷菌可以主動運(yùn)輸?shù)姆绞侥鏉舛忍荻葘⑽鬯械牧走\(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)內(nèi)，因此可過量吸收磷，達(dá)到較高的除磷效果。 5 結(jié)論 研究中已發(fā)現(xiàn)，在污水磷的高效去除中，活性污泥聚磷菌細(xì)胞中貯存能量的PHB脂質(zhì)顆粒發(fā)揮著重要作用。另外，研究表明短鏈脂肪酸能促進(jìn)磷酸鹽釋放，且PHB的合成與快速降解COD的去除是成正比的。
乙酸鹽的消耗與磷酸鹽釋放呈線性關(guān)系，從研究中得知：消耗1 mol乙酸釋放097 mol分子磷酸鹽。
廢水中磷高效去除的重要因素是在厭氧條件下PHB的大量合成和好氧條件下活性污泥聚磷菌細(xì)胞對磷酸鹽的大量吸收以及大量聚磷酸鹽貯存在細(xì)胞內(nèi)。厭氧條件下PHB大量合成，第一點(diǎn)是短鏈脂肪酸的加入起到促進(jìn)作用。由于污泥發(fā)酵液中含有短鏈脂肪酸，這樣使用投加污泥發(fā)酵液的方法比投加化學(xué)試劑乙酸等既便宜便利又可以促進(jìn)活性污泥中PHB大量合成，從而提高磷去除效率，可以節(jié)省費(fèi)用便于推廣。 參考文獻(xiàn)：
［1］Tian ShuyuanThe Effects of Short Chain Fatty Acid on Biological Phosphat Release and PHB Synthesis under Anaerobic Condition［J］Transactions of Tianjin University,1996,2(2)
作者簡介：田淑媛(1945-)，女，天津人，天津大學(xué)副教授，研究方向：污水處理。
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收稿日期：2000-03-10 | 
