尹軍
吉林建筑工程學(xué)院

　　摘要：在大量研究工作基礎(chǔ)上，對檢測消化污泥脫氫酶活性所涉及的內(nèi)源代謝脫氫酶活性與基質(zhì)代謝脫氫酶活性的區(qū)別、投加基質(zhì)、樣品前處理、酶反應(yīng)終止劑、三苯基甲月替(TF)的萃取劑及其濃度問題進(jìn)行了探討。
　　關(guān)鍵詞：脫氫酶活性；測定；消化污泥
　　中圖分類號：X703
　　文獻(xiàn)標(biāo)識碼：C
　　文章編號：1000-4602(2000)10-0047-03

　　脫氫酶是生物細(xì)胞內(nèi)催化有機(jī)物氧化(脫氫)，并將其傳遞給最終電子受體的氧化還原酶，這類酶的活性可以通過加入人工受氫體的辦法進(jìn)行檢測。通常用于檢測脫氫酶活性的人工受氫體包括TTC、刃天青、亞甲基藍(lán)以及INT等，其中研究和應(yīng)用最多的是TTC試驗(yàn)。
　　TTC(2，3，5—氯化三苯基四氮唑)是最早被人們發(fā)現(xiàn)的人工受氫體，它首先是由Kuhu和Jerchel用于生化分析實(shí)驗(yàn)中的。自從Bucksteeg和Thiele提出TTC—試驗(yàn)以來，國外一些學(xué)者早在60年代就已將這一生化分析技術(shù)逐步應(yīng)用到廢水生物處理領(lǐng)域。70年代Klapwijk等和Ryssov-Nielsen在廢水處理活性污泥法的研究中，都曾對TTC—試驗(yàn)作過改進(jìn)。目前，國內(nèi)有關(guān)文獻(xiàn)資料所介紹的TTC—脫氫酶活性測定法，多與Klapwijk所提出的TTC—試驗(yàn)的改進(jìn)方法有關(guān)。
　　80年代以來，國內(nèi)外雖然也有利用TTC—試驗(yàn)進(jìn)行活性污泥和厭氧消化污泥生化活性分析的報道，但由于TTC—試驗(yàn)中高溫(90 ℃)萃取嚴(yán)重影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確度，致使該項(xiàng)生化分析技術(shù)的推廣應(yīng)用受到限制。為了建立穩(wěn)定可靠、簡便易行的TTC—脫氫酶活性測定方法，以便使TTC—脫氫酶活性測定技術(shù)在環(huán)境監(jiān)測，特別是在水處理技術(shù)領(lǐng)域得到普遍應(yīng)用，對檢測好氧消化污泥脫氫酶活性所涉及的內(nèi)源代謝脫氫酶活性與基質(zhì)代謝脫氫酶活性的區(qū)別、投加基質(zhì)、樣品前處理、酶反應(yīng)終止劑、三苯基甲月替的萃取劑及其濃度等問題進(jìn)行若干探討與分析。

　　1 內(nèi)源代謝與基質(zhì)代謝脫氫酶活性的區(qū)別

　　脫氫酶活性測定屬于生物化學(xué)分析技術(shù)范疇，其實(shí)驗(yàn)過程設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)條件的選擇，都應(yīng)從生物學(xué)原理出發(fā)以及注意到檢測樣品的生物學(xué)特性。例如，消化污泥的生物學(xué)特性不同于活性污泥，從微生物呼吸類型方面看，其微生物維持生命活動的能量來源于細(xì)胞組成物質(zhì)的氧化分解，即所謂內(nèi)源代謝(Endogenous Metabolism)，而活性污泥微生物維持生命活動的能量來源于細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)基質(zhì)的氧化分解，即基質(zhì)代謝(Substrats Metabolism)。另外，內(nèi)源代謝過程總是伴隨著不可生物降解物的積累和衰老細(xì)胞的溶解及其胞質(zhì)釋放，這些代謝活動的副產(chǎn)物及其殘存的細(xì)胞碎片，使得污泥體系內(nèi)各種成分更為復(fù)雜，而活性污泥在代謝活動過程中則無明顯的上述情況。因此，消化污泥脫氫酶活性測定與活性污泥脫氫酶活性測定的實(shí)驗(yàn)過程及其條件必然有以下明顯差別：①消化污泥樣品前處理主要目的是去除內(nèi)源代謝積累的副產(chǎn)物和細(xì)胞溶解物，而活性污泥樣品前處理主要目的是去除混合液中的復(fù)合基質(zhì)；②消化污泥樣品培養(yǎng)在不加外源性基質(zhì)條件下進(jìn)行，而活性污泥樣品培養(yǎng)則往往要加入人工配制的單一基質(zhì)或復(fù)合基質(zhì)；③消化污泥內(nèi)源代謝速度緩慢，因此樣品培養(yǎng)時間較長，而活性污泥基質(zhì)代謝速度較快，樣品培養(yǎng)時間較短；④消化污泥樣品成分復(fù)雜，因此在選擇酶反應(yīng)終止劑時，需要考慮終止劑能否與樣品中細(xì)胞殘片或某種生物大分子發(fā)生顏色反應(yīng)干擾比色分析的問題，而在選擇活性污泥酶反應(yīng)終止劑時，則無需注意此類問題。

　　2 測定中是否另加基質(zhì)的問題

　　Bucksleeg和Thiele在測定活性污泥脫氫酶活性時，并沒有加入有機(jī)基質(zhì)，而Lenhard等人卻在測定活性污泥脫氫酶活性時，向培養(yǎng)體系內(nèi)加入了TTC—葡萄糖復(fù)合試劑。Altman對四唑鹽作用原理和特殊脫氫酶活性應(yīng)用方面進(jìn)行了述評，認(rèn)為TTC是唯一的一種被用來測定廢水污泥普通脫氫酶活性的物質(zhì)，一些研究者在恒溫培養(yǎng)的樣品中加入葡萄糖或乳酸鹽等基質(zhì)，實(shí)際上已經(jīng)使測定過程特殊化了。例如，高濃度乳酸鹽的加入，則意味著測定的是乳酸脫氫酶活性，而不是一般脫氫酶活性。Klapwijk等認(rèn)為，樣品中缺乏有機(jī)基質(zhì)時，所測得的是內(nèi)源呼吸的脫氫酶活性，而加入基質(zhì)時，可測得最大基質(zhì)呼吸的脫氫酶活性，基質(zhì)的選擇應(yīng)該是活性污泥法污水處理廠進(jìn)水的主要成分之一。他還用單一基質(zhì)(如醋酸鈉、乳酸鈣、葡萄糖)和“混合基質(zhì)”(含尿素、明膠、可溶性淀粉等)進(jìn)行對比試驗(yàn)，結(jié)果證明乳酸鈣是試驗(yàn)中最佳單一基質(zhì)。筆者也曾對乳酸鈣在脫氫酶活性測定中的作用問題進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)加入乳酸鈣比不加乳酸鈣的測定值增加1.5～2.5倍。因此，在研究基質(zhì)代謝速率及其與脫氫酶活性關(guān)系時，可以選用4.6%乳酸鈣作為有機(jī)基質(zhì)，而在研究活性生物量或消化污泥生化活性時，則不必外加基質(zhì)。

　　3 測定樣品的前處理

　　Klapwijk的方法沒有對污泥樣品前處理問題提出明確的要求；Ryssov Nielsen采用10%(pH＝7.5)磷酸鹽緩沖液對活性污泥進(jìn)行洗滌；日本學(xué)者瀧田久憲在INT—脫氫酶活性測定時，曾用BOD稀釋水反復(fù)洗滌活性污泥三遍，認(rèn)為檢測經(jīng)洗滌后污泥樣品的脫氫酶活性為內(nèi)源性脫氫酶活性；國內(nèi)有些學(xué)者則主張用生理鹽水處理污泥樣品，我們研究發(fā)現(xiàn)用純水洗滌污泥樣品測定脫氫酶活性的效果較好。通過純水洗滌污泥樣品，一方面可去除消化污泥中殘存的基質(zhì)和可溶性的細(xì)胞溶解物，有利于內(nèi)源性脫氫酶活性的顯現(xiàn)，另一方面能夠調(diào)節(jié)污泥樣品的pH，有利于TTC還原為甲月替(TF)。

　　4 酶反應(yīng)終止劑的選擇

　　Lenhard和Jones等曾采用乙醇和丁醇終止樣品污泥的酶反應(yīng)。Klapwijk等和國內(nèi)一些學(xué)者均主張用濃硫酸終止酶反應(yīng)，這是為了避免丁醇受熱易蒸發(fā)的問題，并發(fā)現(xiàn)向樣品中加1滴硫酸，便可立即停止酶反應(yīng)，同時使污泥變得完全無色。另外，Ryssov-Nielsen在終止活性污泥酶反應(yīng)時采用了物理方法，由于用硫酸來終止酶反應(yīng)會使顯色液褪色，背景值增大，特別是可使污泥齡較長的樣品出現(xiàn)茶色反應(yīng)，使空白值與樣品值發(fā)生逆轉(zhuǎn)，這種反常情況的出現(xiàn)可能與消化污泥內(nèi)源代謝的自身特性有關(guān)。因此，我們通過實(shí)驗(yàn)比較了幾種有機(jī)化合物終止酶反應(yīng)的效果。實(shí)驗(yàn)表明，采用與培養(yǎng)液等體積的丙酮終止酶反應(yīng)效果很理想，從未出現(xiàn)過像用硫酸終止酶反應(yīng)的不良效果。但是需注意的問題是，如果脫氫酶活性檢測中酶反應(yīng)的終止與萃取步驟合并進(jìn)行，那么采用丙酮終止酶反應(yīng)是完全可以的，然而實(shí)際上要突破高溫萃取測定結(jié)果不穩(wěn)定這一技術(shù)難關(guān)，就不能將酶反應(yīng)終止與萃取合并進(jìn)行。正是為了這個目的，我們又比較了丙酮、乙醇與甲醇在消化污泥脫氫酶反應(yīng)終止方面的作用效果，發(fā)現(xiàn)采用占培養(yǎng)液體積1/10的甲醛終止酶反應(yīng)效果顯著優(yōu)于乙醇，但從空白值大小方面看，甲醛往往略大于丙酮，且在污泥濃度很高時，空白對照中還有程度不同的黃色素。由于甲醛對酶反應(yīng)終止作用迅速，試劑用量少，因此選用甲醛作為酶反應(yīng)終止劑是合適的。

　　5 萃取劑的選擇

　　國外研究者曾采用過的萃取劑有甲醇、乙醇、丙醇，Klwpwijk等則選用丁醇作為萃取劑。國內(nèi)學(xué)者陳頌原發(fā)現(xiàn)，丙酮和甲醛萃取TF的效果優(yōu)于乙醇。我們的對比實(shí)驗(yàn)表明，丙酮不但萃取TF的效果優(yōu)于甲醇、乙醇、異丙醇，而且萃取液顏色相當(dāng)穩(wěn)定，這可能與丙酮自身化學(xué)特性有關(guān)。據(jù)資料介紹，丙酮具有選擇性溶解某些有機(jī)物的特性，且在水溶液中能夠抑制物質(zhì)離解。因此認(rèn)為，丙酮應(yīng)作為脫氫酶活性測定中TF萃取分離的首選試劑。
　　到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)有人提出或研究有關(guān)萃取劑濃度對萃取效果影響的問題。在Klapwijk等提出TTC—試驗(yàn)改進(jìn)方法以后，國內(nèi)一些文獻(xiàn)資料幾乎都是把TTC—試驗(yàn)中TF萃取溫度定為90 ℃。這里實(shí)際上忽略了萃取濃度問題，操作上大都在酶反應(yīng)終止劑加入的同時，立刻加入與樣品培養(yǎng)液等體積的萃取劑進(jìn)行90 ℃高溫萃取，這樣相當(dāng)于萃取劑被稀釋1倍。采用不同濃度丙酮水溶液于37 ℃條件下萃取消化污泥樣品TF的結(jié)果表明，TF萃取效果受丙酮濃度影響，但并非100%丙酮萃取效果最佳。在丙酮濃度分別為100%、80%、60%、40%、20%的幾組對比實(shí)驗(yàn)中，TF的最大測定值均發(fā)生在80%丙酮濃度條件下，60%丙酮萃取TF的測定值僅為最大測定值的58.36%。這個發(fā)現(xiàn)很重要，既為提高TTC—試驗(yàn)中TF檢出量找到一種可行的技術(shù)途徑，也為本項(xiàng)研究獲得由高溫萃取為常溫萃取的突破性進(jìn)展打下了基礎(chǔ)。
　　在以往的TTC—試驗(yàn)中，Ryssov-Nielsen曾用溶菌酶破壞細(xì)胞壁的辦法提高萃取效率。然而，其他學(xué)者為什么要采取高溫條件下萃取TF呢?按照傳統(tǒng)的觀點(diǎn)來看，無非是說高溫條件可以破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，改進(jìn)細(xì)胞的透性，以利于萃取劑對TF結(jié)晶發(fā)生溶解作用。我們認(rèn)為，除上述原因以外，高溫條件實(shí)際上就是為了彌補(bǔ)萃取劑濃度不適，提高TF萃取能力不足而采取的強(qiáng)化措施。從這個觀點(diǎn)上看，我們完全可以采取選擇最佳萃取劑及其最適濃度的辦法，將原有TTC—試驗(yàn)中高溫萃取操作改進(jìn)為常溫萃取。按照這種設(shè)想，我們將終止酶反應(yīng)后的樣品培養(yǎng)液進(jìn)行離心，棄去上清液，然后用丙酮于37 ℃條件下萃取TF，并與原有的TTC—試驗(yàn)進(jìn)行對比，結(jié)果是前者的測定值高于后者，證明常溫萃取TF是可行的。
　　在TTC—試驗(yàn)中，以常溫(37 ℃)萃取TF代替高溫萃取，是脫氫酶活性測定研究中的一項(xiàng)重大突破，這不但有利于提高脫氫酶活性檢測分析方法的可靠性，而且必將會對脫氫酶活性測定這一生化分析技術(shù)的廣泛應(yīng)用起到積極的推動作用。

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　　收稿日期：2000-04-11