童中華 胡洪營 魏東斌
(清華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系 環(huán)境模擬與污染控制國家重點(diǎn)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室 北京 100084)

　　在發(fā)光細(xì)菌的應(yīng)用過程中人們發(fā)現(xiàn)并分離出了它的自發(fā)暗變種（K變種），如1980年Ulitzue等從鮒魚發(fā)光桿菌P. leiognathifenli分離到自發(fā)暗變種，并根據(jù)化合物使暗變種恢復(fù)發(fā)光的能力檢測其致突變性，證明在各種堿基置換劑和移碼劑存在下，可大大提高暗變種在世代中的回復(fù)突變率。文獻(xiàn)證明DNA合成抑制劑和DNA插入劑也可提高其回復(fù)突變率。該項(xiàng)技術(shù)已被美國Azur公司（原Microbics公司）定名為Mutatox^TM方法。
　　顧宗濂于1993年首次在國內(nèi)報(bào)道利用自行分離到的明亮發(fā)光桿菌的自發(fā)暗變種T9171菌株，測試五種遺傳毒物的致突變性，指出暗變種對化合物致突變效應(yīng)的靈敏度高于Ames試驗(yàn)，發(fā)光細(xì)菌暗變種試驗(yàn)可望成為一種簡易靈敏的生物致突變性測試方法。
　　本文對發(fā)光細(xì)菌暗變種的檢測原理、測試方法和應(yīng)用研究作簡要介紹，并與Ames試驗(yàn)進(jìn)行比較，以推進(jìn)暗變種方法在我國環(huán)境監(jiān)測中的研究和應(yīng)用。

1. 檢測原理
　　對發(fā)光細(xì)菌經(jīng)過理化方法誘變處理后，使其失去發(fā)光能力或發(fā)光強(qiáng)度極弱，稱為暗變種（K. variant）。若暗變種接觸致突變物，在世代分裂時(shí)可導(dǎo)致突變，恢復(fù)一定程度的發(fā)光能力。利用暗變種恢復(fù)發(fā)光的現(xiàn)象，可對各種遺傳毒物或環(huán)境樣品進(jìn)行篩選、檢測。這可能是由于致突變物使調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，使其不能產(chǎn)生或產(chǎn)生無活性的抑制物質(zhì)，也可能使DNA雙鏈發(fā)生構(gòu)象改變，使抑制物質(zhì)不能與之結(jié)合而失去抑制效應(yīng)，總之，真正的回復(fù)突變機(jī)理目前還不清楚。

2. 測試方法
　　AZUR 公司采用費(fèi)氏弧菌Vibrio fischeri 的暗變種M 169，制成凍干粉于-20℃保存，測定前復(fù)蘇，在27-30℃與待測物接觸16，20，24小時(shí)或更長時(shí)間以后檢測發(fā)光強(qiáng)度，同時(shí)做陰性和陽性對照。一般規(guī)定，對某一化合物的所有測試濃度，若樣品發(fā)光比陰性對照發(fā)光≤2，則認(rèn)為該化合物無致突變性；若樣品的發(fā)光為陰性對照的至少2倍，則認(rèn)為反應(yīng)陽性，至少連續(xù)2個(gè)濃度為陽性才能確定為有致突變性。
　　顧宗濂在研究初期采用暗變種的新鮮培養(yǎng)液，20℃環(huán)境中待測物與培養(yǎng)液在測定管中靜止培養(yǎng)，于0，14小時(shí)以后每隔4小時(shí)測發(fā)光強(qiáng)度，至各管發(fā)光強(qiáng)度達(dá)最大值后明顯下降為止。若樣品的最大發(fā)光值為同一時(shí)間空白對照的至少2倍，則認(rèn)為反應(yīng)陽性。1999年謝思琴、顧宗濂等報(bào)道了采用4℃保存的暗變種凍干粉，20℃振蕩復(fù)蘇，與待測化合物接觸振蕩培養(yǎng)24小時(shí)后每隔3-4小時(shí)測定一次發(fā)光強(qiáng)度。以樣品發(fā)光強(qiáng)度為空白對照的3倍者為陽性效應(yīng)，若樣品的5個(gè)平行系列中有3個(gè)陽性效應(yīng)，即認(rèn)為該樣品具有致突變性；若樣品的平行系列中陽性效應(yīng)數(shù)不足3個(gè)，則認(rèn)為陽性可疑。

3. Mutatox與Ames試驗(yàn)的方法比較
　　Mutatox與Ames試驗(yàn)屬于體外致突變性檢測方法，都是細(xì)菌法，使用大鼠肝臟提取液S9作為代謝活化因子。Mutatox與Ames試驗(yàn)相比具有快速、簡便等特點(diǎn)，具體從以下幾點(diǎn)加以討論：
　　(1) Mutatox試驗(yàn)中使用的發(fā)光細(xì)菌暗變種是從AZUR 公司購買的真空包裝凍干粉，-20℃保存，測試菌株不需要進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，復(fù)蘇凍干粉即可用于試驗(yàn)。Ames試驗(yàn)中菌液準(zhǔn)備工作量大。冷凍保存的菌種先進(jìn)行增菌培養(yǎng)，然后進(jìn)行菌株生物學(xué)性狀的鑒定，若生長及生物學(xué)性狀不符合要求，應(yīng)對其進(jìn)行劃線分離。此外還要進(jìn)行例如各種培養(yǎng)基、營養(yǎng)液的準(zhǔn)備和滅菌等準(zhǔn)備工作。
　　(2) Mutatox試驗(yàn)不需要嚴(yán)格的無菌條件。一般情況下Mutatox測試不受環(huán)境中存在的非發(fā)光細(xì)菌的影響，只有當(dāng)雜菌的濃度過大（約大于105/mL）時(shí)才需要用0.22μm的膜進(jìn)行過濾。同時(shí)，Mutatox測試介質(zhì)含有高濃度鹽、低濃度營養(yǎng)液和一些廣譜性抗菌素，相對高濃度測試菌株的加入，以及測試終點(diǎn)的檢測特點(diǎn)，大大降低了可能進(jìn)入測試系統(tǒng)的雜菌對測試結(jié)果的影響。Ames試驗(yàn)需要進(jìn)行嚴(yán)格的無菌操作，對工作人員的微生物實(shí)驗(yàn)技能要求較高。因?yàn)殡s菌的存在會(huì)嚴(yán)重影響平皿滲入法計(jì)算回變菌落數(shù)。
　　(3) Mutatox方法不需要繁瑣且昂貴的連續(xù)培養(yǎng)，批量生產(chǎn)的凍干粉保證了其品質(zhì)的穩(wěn)定性，并能減小其遺傳變異。試驗(yàn)一般只需要24小時(shí)即可完成，操作簡便、花費(fèi)低。Ames試驗(yàn)一般需要48-72小時(shí)完成，要配制多種培養(yǎng)基，所需材料多、費(fèi)用高、費(fèi)時(shí)較多。
　　(4)為了使Mutatox方法標(biāo)準(zhǔn)化，已經(jīng)有大量的工作比較了Mutatox方法與Ames試驗(yàn)對單一化合物和環(huán)境樣品致突變性檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。Johnson B.T. 對8種典型致突變前體物的檢測結(jié)果證明，Mutatox方法和Ames試驗(yàn)在定性和定量兩方面的靈敏度相近，Mutatox方法可成為檢測復(fù)雜環(huán)境中致突變物質(zhì)的一個(gè)有效的監(jiān)測手段。謝思琴、顧宗濂等對發(fā)光細(xì)菌暗變種T9171的靈敏度進(jìn)行了研究，結(jié)果充分說明T9171試驗(yàn)與Ames試驗(yàn)檢測遺傳毒物所反映的遺傳毒性水平具有較好的一致性。

4．應(yīng)用
　　近年來，科學(xué)工作者已經(jīng)用發(fā)光細(xì)菌暗變種檢測出100多種單一化合物的致突變性，同時(shí)也用于檢測各種環(huán)境樣品的致突變性。Kwan等用Mutatox方法測試了河水和沉積物的有機(jī)提取物的致突變性，同時(shí)檢測了其急性和慢性毒性，證明Mutatox是成組試驗(yàn)（battery of tests）中有用的方法。Békaert等利用Ames和Mutatox試驗(yàn)、活體兩棲動(dòng)物微核試驗(yàn)對被PAHs和重金屬污染的土壤浸出液進(jìn)行致突變性檢測，通過非過濾樣品和過濾樣品的比較試驗(yàn)，指出Mutatox試驗(yàn)中樣品不經(jīng)過0.45μm膜過濾能更準(zhǔn)確地檢出顆粒物上吸附的生物活性污染物的致突變性。
　　此外，Johnson用Mutatox和Microtox方法測定了50多種農(nóng)藥、致突變劑和工業(yè)污染物，Mutatox方法對各種化合物的敏感性與文獻(xiàn)報(bào)道的Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明急性毒性和致突變性之間存在著明顯的相關(guān)性（p<0.05），并利用這兩種方法測試了8個(gè)有機(jī)沉積提取物。
　　1993年以來，我國學(xué)者利用明亮發(fā)光桿菌的自發(fā)暗變種T9171進(jìn)行了一些研究工作。首先研究了T9171暗變種對5種已知的致突變劑的回復(fù)突變效應(yīng)，利用所建立的實(shí)驗(yàn)方法檢測了工業(yè)廢渣的致突變效應(yīng)，結(jié)果與Ames試驗(yàn)結(jié)果的趨勢相似。將暗變種T9171制成凍干粉，采用改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)方法研究了36種有機(jī)化合物的致突變效應(yīng)，并與Ames試驗(yàn)比較，以一致陽性的受試物最低劑量進(jìn)行相關(guān)分析，在0.01的顯著性水平上兩種方法的吻合率達(dá)69%。趙華清等將此方法應(yīng)用于環(huán)境樣品中，檢測了14種環(huán)境水樣和9種化合物的基因毒性，結(jié)果說明加S9能大大提高發(fā)光細(xì)菌暗變種的檢測靈敏度。

　　Mutatox方法在國際上已經(jīng)得到了一定程度的應(yīng)用，但是由于凍干粉價(jià)格相對較高，很難在我國推廣。我國學(xué)者自行分離出暗變種T9171，并進(jìn)行了初步的研究，但該法的測定步驟及其判斷標(biāo)準(zhǔn)還有待于進(jìn)一步完善。隨著簡便、快速、經(jīng)濟(jì)的發(fā)光細(xì)菌暗變種測試方法的逐步成熟，并與其它化學(xué)和生物測試方法聯(lián)合，應(yīng)用前景將會(huì)非常廣闊。