馬 軍， 邱立平， 馮 琦
( 哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政環(huán)境工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱1500 90)

　　 摘 要： 綜述了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))的原理、方法及其研究進(jìn)展，介紹了PCR及其相關(guān)技術(shù)在水體微生物檢測中的優(yōu)勢和應(yīng)用研究現(xiàn)狀，分析了該技術(shù)在水體微生物檢測中存在的問題及解決方法。PCR技術(shù)的應(yīng)用將極大地提高水體微生物檢測速度、靈敏度和準(zhǔn)確度，對(duì)于評(píng)價(jià)水處理過程中細(xì)菌、病毒、病原原生生物等的去除效率也將具有重要意義。
　　關(guān)鍵詞： PCR； DNA； 水體微生物； 檢測
　　中圖分類號(hào)：X832
　　文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B
　　文章編號(hào)： 1000-4602(2002)01-0034-03

1 PCR技術(shù)及其發(fā)展

　　PCR技術(shù)最早于1985年由美國人類基因?qū)W會(huì)(ASHG)年會(huì)在DNA片段擴(kuò)增工作的研究中得以描述，由此開始在各個(gè)相關(guān)領(lǐng)域得到了迅速而廣泛的研究，現(xiàn)已成為一個(gè)世界性的前沿課題。
　　PCR是一種具有選擇性的體外DNA或RNA擴(kuò)增方法。通過選擇某一特定微生物物種的一段特異性基因區(qū)域(即所謂“目標(biāo)序列”)進(jìn)行體外擴(kuò)增，再由凝膠電泳等DNA分析技術(shù)確定其種類及含量。PCR技術(shù)的特異性是由人工合成的引物DNA序列確定的。所謂引物是指與待擴(kuò)增核酸 片段兩端互補(bǔ)的寡核苷酸，即ssDNA(單鏈DNA)。PCR反應(yīng)包括目標(biāo)DNA序列的加熱變性、引物退火復(fù)性和在DNA聚合酶作用下的引物延伸三個(gè)階段。其做法為：環(huán)境水樣中微生物經(jīng)預(yù)處 理后取得DNA樣板，在變性溫度下DNA變性解旋；在復(fù)性溫度下兩引物分別與兩條DNA的兩端 互補(bǔ)性結(jié)合，此時(shí)引物的3′端相對(duì)，5′端相背，稱引物與模板的雜交；在延伸溫度和適當(dāng) 的pH值及離子強(qiáng)度下，由TaqDNA聚合酶催化引物引導(dǎo)的DNA由5′端向3′端延伸，從而完成一個(gè)變性—復(fù)性—延伸的PCR循環(huán)。通過不斷的PCR循環(huán)，可以使擴(kuò)增DNA產(chǎn)量呈上升指數(shù)， 達(dá)到體外擴(kuò)增特定DNA序列的目的。
　　最先利用PCR技術(shù)擴(kuò)增而出的DNA序列是人的β—球蛋白基因［1］，并在1987年6月首次臨床應(yīng)用。有關(guān)DNA提取、引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)溫度、擴(kuò)增產(chǎn)物的分析技術(shù)等方面的研究成果逐 漸增多，已相繼建立了套式PCR(nested PCR)、半巢式PCR(semi-nested PC R)、反向(逆轉(zhuǎn)錄)PCR(reverse transcriptase-mediated PCR)、競爭性PCR(competitive P CR)等技術(shù)方法。PCR技術(shù)在已進(jìn)行的微生物檢測研究中充分顯示了其快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，如Niederhauser等人［2］利用PCR技術(shù)檢測食品中的單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytoge nes)只需32～56 h，而傳統(tǒng)方法為10d。

2 在水體微生物檢測中的應(yīng)用

　　目前PCR技術(shù)應(yīng)用于水體微生物檢測研究的重點(diǎn)是給水的微生物檢測，尤其是近年來引起人們廣泛關(guān)注的病原微生物，諸如軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)、賈第蟲(Giardia)、隱孢子蟲(Cryptosporidium)及一些腸道病毒等的PCR檢測方法研究。研究的內(nèi)容包括DNA物質(zhì)提取方法的改進(jìn)、樣品中PCR抑制物的去除、PCR方法的改進(jìn)與比較、擴(kuò)增產(chǎn)物的分析技術(shù)等。
2.1 供水衛(wèi)生學(xué)安全檢測
　　最早的水體細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)始于1885年，流行病學(xué)的證據(jù)表明［1］，在過去的60年中工業(yè)化國家由水媒病原微生物所引起的爆發(fā)性流行病發(fā)病率已有了明顯的下降，這其中供水的衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)功不可沒。
　　與傳統(tǒng)方法相比，PCR方法不僅檢測時(shí)間短、靈敏度高，還可以檢出一些依靠培養(yǎng)法不能檢測的微生物種類。PCR方法已在糞便污染指示菌及病原細(xì)菌［3］、病毒［4］ 、軍團(tuán)菌和病原原生生物［5～7］等的檢測中有了比較深入而廣泛的研究，取得了較好的應(yīng)用成果。如Zehr等［8］利用PCR技術(shù)直接從海水DNA樣品中特異性地?cái)U(kuò)增一種目前常規(guī)方法無法培養(yǎng)的Trichodesmium thiebautii菌株的固氮基因(nif)片段。Catalan等［9、10］分別檢測了污水和飲用水中軍團(tuán)菌污染情況。對(duì)于生物污染嚴(yán)重的污水中的軍團(tuán)菌用常規(guī)的分離培養(yǎng)法不可能檢出，而用套式PCR方法則可極其準(zhǔn)確地檢出，檢測時(shí)間僅為4h,而用培養(yǎng)法檢測飲用水中的軍團(tuán)菌需7～10 d。Catalan等還進(jìn)行了腸道病毒 的PCR方法檢測研究，發(fā)現(xiàn)PCR法不僅可將檢測時(shí)間從培養(yǎng)法的3～4周縮短到8h，還大大地提高了靈敏度和選擇性。Fricker等［1］報(bào)道的一種用于檢測病毒的PCR新方法可在24h內(nèi)得到測定結(jié)果，并且極其靈敏。他們開創(chuàng)的一種基于PCR的E.coli.檢測方法可以在2 4 h內(nèi)完成對(duì)99種不同的環(huán)境水樣檢測，取得了與標(biāo)準(zhǔn)方法100%吻合的檢測結(jié)果，該方法已列為泰晤士河的例行檢測項(xiàng)目。Hallier-Soulier等［5］利用免疫磁分離PCR技術(shù) 檢測飲用水中Cryptosporidium parvum卵囊蟲的靈敏度達(dá)到了可以在5～100 L水樣中檢出一個(gè)蟲體。Heiber等［11］利用與核酸探針技術(shù)結(jié)合的PCR方法檢測糞便污染指示菌，有效地排除了一些抑制物的干擾，可以對(duì)E.coli等進(jìn)行快速測定。一些學(xué)者還進(jìn)行了多個(gè)引物同時(shí)應(yīng)用的嘗試［12］，以期提高檢測效率。近一時(shí)期，基于PCR技術(shù)的16SrD NA檢定技術(shù)等也在水體微生物檢測領(lǐng)域被廣泛研究［13］。
2.2 廢水生物處理過程的監(jiān)測與評(píng)價(jià)
　　常規(guī)檢測方法受采樣及分析條件的影響極大，結(jié)果準(zhǔn)確性差，檢測時(shí)間長，并且有些種類( 如厭氧菌)分離困難，而PCR技術(shù)不僅克服了這些缺點(diǎn)，還為一些生物參數(shù)應(yīng)用于水處理工藝的自動(dòng)控制提供了可能。由于水處理過程中生物氧化作用是由多菌種共同作用的結(jié)果，因此各不同菌群之間的相互作用至關(guān)重要。由PCR技術(shù)發(fā)展而帶動(dòng)的基于多態(tài)性技術(shù)在微生物生態(tài)系的研究取得了迅速進(jìn)展，如DGGE(Denaturing gradient gel electrophoresis)技術(shù)、RAPD(Randomly amplified polymorphic DNA)技術(shù)都可以檢測各種生物反應(yīng)器中的微生物種群結(jié)構(gòu)。Selvaratnam等人［14］用編碼苯酚單加氧酶dmpN基因的RT—PCR技術(shù) 來檢測處理廢水的SBR反應(yīng)器中降解酚的假單胞菌。結(jié)果表明，RT—PCR方法不僅能檢測出微生物降解酚的能力，還能測量出dmpN基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而確定該假單胞菌特殊的分解活性，而且發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平條件下，酚濃度與通氣時(shí)間之間存在正相關(guān)關(guān)系。Ferris等人［14］用DGGE分析16SrDNA基因的擴(kuò)增產(chǎn)物來繪制一組微生物種群的16SrDNA基因圖譜。RA PD(randomly amplified polymorphic DNA)技術(shù)也是應(yīng)用比較廣泛的一種以多態(tài)性引物來擴(kuò) 增某些片段的技術(shù)。RAPD分析用于檢測含有混合微生物種群的各種微生物反應(yīng)器中的微生物多樣性。用RAPD分析所得到的基因組指紋圖譜在比較一段時(shí)間內(nèi)微生物種群的變化以及比較小試和中試規(guī)模的反應(yīng)器方面是有用的，但還不足以用來估測群落的生物多樣性。用RAPD分析檢測 實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的油性淤泥培養(yǎng)料中的細(xì)菌菌群發(fā)現(xiàn)，用油脂淤泥改良過的培養(yǎng)料比未經(jīng)改良的更適合于不同的微生物種群生長。Vainio等人^［14］將從516種孤立的菌落中提取出的16SrDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測序來檢測活性污泥中微生物種群的結(jié)構(gòu)。這些組合技術(shù)的應(yīng)用大大增強(qiáng)了對(duì)微生物的檢測和鑒定能力，從而為理論研究工藝優(yōu)化及生物處理效率的提高提供了條件。
2.3 存在的問題及解決方法
　?、? PCR反應(yīng)能夠被自然界中一些物質(zhì)所顯著抑制，例如胡敏酸、富里酸、某些離子及糖類 物質(zhì)等可以干擾Taq聚合酶的作用。同樣，環(huán)境水樣在濃縮、保存和提純過程中可能從環(huán)境 及中間處理環(huán)節(jié)帶來一些潛在的PCR反應(yīng)抑制劑，例如EDTA、十二烷基硫酸鈉和一些胍基化合物等，另外還可能有一 些共存物質(zhì)可能抑制PCR反應(yīng)。這些抑制劑一方面可能抑制PCR反應(yīng)；另一方面還可能造成 假陽性結(jié)果。因此，研究環(huán)境樣品中待擴(kuò)增DNA或RNA的提純技術(shù)以消除抑制物的影響［9、15］是十分重要的。對(duì)水體樣品的提純比其他環(huán)境水樣相對(duì)容易些，這也為PCR技術(shù)在水體檢驗(yàn)中的廣泛應(yīng)用提供了有利條件。
　　② 檢測對(duì)象的生物活性。由于DNA的檢測并不意味著必須使用活細(xì)胞，從理論上講任何可以提供核酸物質(zhì)的樣品都可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這就是說PCR技術(shù)不能區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，尤其是在水體衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)中不能確定所檢出的病毒粒子是否具有感染能力，這是一個(gè)待解決的問題。如果擴(kuò)增mRNA的技術(shù)取得突破也許會(huì)對(duì)解決這個(gè)問題提供很大的幫助，這在一定程度上取決于使用什么樣的引物。Fricker等［1］認(rèn)為rRNA擴(kuò)增及現(xiàn)場雜交技術(shù)來鑒定細(xì)菌和原生生物活性的方法，其有效性尚待在環(huán)境樣品的實(shí)際檢驗(yàn)中證明。
　　PCR技術(shù)的不足會(huì)逐漸得到改進(jìn)，但全面將其作為標(biāo)準(zhǔn)方法來使用尚需做很多工作。

3 結(jié)語

　　PCR技術(shù)為水工業(yè)技術(shù)研究及評(píng)價(jià)提供了快速、方便的檢測手段，對(duì)于保障安全供水、促進(jìn)廢水生物處理工藝研究有著重要意義。PCR技術(shù)具有快速、靈敏、準(zhǔn)確和簡便等特點(diǎn)，有傳統(tǒng)方法無可比擬的優(yōu)勢。PCR及其相關(guān)技術(shù)的研究應(yīng)用和不斷推廣必將提高水體微生物的檢測水平，促進(jìn)水工業(yè)的發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

　?。?］ Fricker E J,Murrin K,Fricker C R.The use of PCR for the detection of bacteria an d viruses［J］.Water Supply，2000,17(2):5-16.
　?。?］ Niederhauser C U,Candian C,Hofelein M,et al.Use of polymerase chain reaction for detection of listeria monocytogenes in food［J］.Appl Environ Microbiol，19 92,58(5):1564-1568.
　?。?］ Bej A K,Steffan R J,DiCesare J，et al.Detection of coliform bacteria in wate r by polymerase chain reaction and gene probs［J］.Appl Environ Microbiol，1990, 56(2):307-314.
　?。?］ Abbaszadegan M,Huber M S,Gerba C P,et al.Detection of enteroviruses in groun dwater with polymerase chain reaction［J］.Appl Environ Microbiol，1993,59(5):13 18-1324.
　?。?］ Hallier-Soulier S,Guillot E.Immunomagnetic separation-PCR for ultra-sensitive an d specific detection of Cryptosporidium parvum oocysts from drinking water sampl es［J］.Water Supply，2000,17(2):45-47.
　　［6］ Stinear T,Matusan A,Hines K,et al.Detection of a single viable Cryptosporidi um parvum oocysts in environmental concentrates by reverse transcription-PCR［J ］.Appl Environ Microbiol，1996,62(10):3385-3390.
　?。?］ Rochlle P A,Ferguson D M,Handojo T J,et al.Development of a rapid detection procedure for Cryptosporidium using in vitro cell culture combined with PCR［J］ .Journal of Eukaryotic Microbiology，1996,43(1):72-79.
　?。?］ Zehr J P,McReynolds L A.Use of degenerate oligonucleotides for amp lification of the nifH gene from the marine cyanobacterium trichodesmium thiebau tii［J］.Appl Environ Microbiol，1989,55(10):2522-2526.
　?。?］ Catalan V,Moreno C,Dasi M A，et al.Nested polymerase chain reaction for dete ction of Legionella pneumophila in water［J］.Research in Microbiology，1994,145 (3):603-610.
　?。?0］ Catalan V,Garcia F,Moreno C，et al.Detection of Legionella pneumophila in wa stewater by nested polymerase chain reaction［J］.Research in Microbiology，1997 ,148(1):71-78.
　?。?1］ Heiber I,Frahm E,Obst U.Molecular biological detection of hygienically relevant microorganisms in water samples based on specific nucleic acid probes and magnet ic beads［J］.Water Supply，1999,17(2):1-3.
　?。?2］ Bej A K,Mahbubani M H,Miller R，et al.Multiplex PCR amplification and immobi lized capture probes for detection of bacterial pathogens and indicators in wate r［J］.Molecular Cell Probes，1990,4(2):353-365.
　?。?3］ Jensen M A,Webster J A,Strauss N. Rapid identification of bacteria on the basis of polymerase chain reaction amplified ribosomal DNA spacer polymorphisms［J］. Appl Environ Microbiol，1993,59(3):945-952.
　?。?4］ 岳春梅,明鎮(zhèn)寰.分子生物學(xué)技術(shù)在環(huán)境微生物監(jiān)測中的應(yīng)用［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2000,27( 2):215-218.
　?。?5］ Tasai Y L,Olson B H.Rapid method for separation of bacterial DNA from humic subs tances in sediments for polymerase chain reaction［J］.Appl Environ Microbiol， 1992,58(7):2292-2295.

　　電　話：(0451)6282292
　　傳　真：(0451)2368074
　　E-mail:majun@mail.hrbucea.edu.cn
　　收稿日期：2001-10-30