李霞　 王向東　 林松　 宋若遠(yuǎn)
(四川大學(xué)建筑與環(huán)境學(xué)院，四川 成都，610065)

　　摘要：本文從活性污泥中篩選出了具有較高絮凝活性的混合菌MBFH，研究了各種條件對微生物產(chǎn)絮凝劑的影響。研究結(jié)果表明，混合菌MBFH產(chǎn)絮凝劑的最佳培養(yǎng)條件為：溫度30℃、初始pH值8.0、搖床轉(zhuǎn)速為120r／min、培養(yǎng)基含糖量為2％、相對接種量為15％，其對高嶺土懸濁液的絮凝率可達(dá)到88％。
　　關(guān)鍵詞：混合型絮凝劑產(chǎn)生菌　 正交試驗(yàn)　 培養(yǎng)條件　 生長曲線　

Study on optimum culture conditions of mixed flocculant－producing stain
Liaxia　 　Wangxiangdong　 　Linsong　　 Songruoyuan

　　Abstract: The mixed strains of MBFH which produced flocculating material was screened from activated sludge. In this paper, culture conditions for production of microbial flocculant were studied. The optimum culture conditions were found to be mixed microbial MBFH ,30℃, initial pH 8.0 , agitation rate 120rpm,the concentration of glucose 2%, relatively inoculums 15%,and the maximal fractional flocculation was about 88% in that conditions.
　　Key words: mixed flocculant-producing stain, culture conditions, growth curve, orthogonal test

　　微生物絮凝劑是利用生物技術(shù),通過生物發(fā)酵、抽提、精制而得到的一種具有生物分解性和安全性的新型、高效、無毒的廉價(jià)的水處理劑[1]，因此具有逐步取代傳統(tǒng)絮凝劑的趨勢，并且應(yīng)用的前景十分廣泛。目前對其的研究已成為當(dāng)今世界絮凝劑研究的主要課題，但是對微生物絮凝劑的研究依然存在較大的局限性，且人們重點(diǎn)研究的仍是單一菌種，由于微生物自身的特點(diǎn)使其菌體的生長受到很多因素的影響，致使其所產(chǎn)生的絮凝劑的絮凝效果同樣受到很多條件的制約，而且由于微生物的培養(yǎng)成本較高使其在工業(yè)上的應(yīng)用同樣受到一定的限制。而混合菌種具有適應(yīng)環(huán)境的能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，這樣既可以提高菌種的生存能力又可以降低對其培養(yǎng)所需的成本。因此人們將微生物絮凝劑的研究方向投向既有生物降解能力又有絮凝能力的混合菌種[2]。本文從活性污泥中篩選出了絮凝效果較單一菌種好的混合菌種，通過研究確定了此混合型微生物絮凝劑產(chǎn)生菌合成絮凝劑的最佳培養(yǎng)條件，為其可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 菌種來源及培養(yǎng)基
　　菌種來源：污水處理廠二沉池的活性污泥
　　篩選培養(yǎng)基：葡萄糖10g，K2HPO4 　5g，MgSO4·7H2O 0.2g，尿素0.5g，KH2PO4 　2g，，NaCl 0.1g，酵母膏0.5g，水1000ml，pH值 7.5。
　　發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20g，硫酸銨2g，KCl 0.5g，K2HPO4 　0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，水 1000ml, pH值 7.0。
1.2 菌種分離與篩選
　　將活性污泥經(jīng)篩選培養(yǎng)基富集培養(yǎng)后采用平板菌落稀釋法[3] 得到單菌落，將其制成菌懸液后按10％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，試驗(yàn)條件：溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速150r/min,pH值為7，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)。測定其發(fā)酵液的絮凝率，將篩選出的具有一定絮凝活性的菌株兩兩混合按1：1的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以發(fā)酵液的絮凝率作為混合菌株篩選指標(biāo)。
1.3 絮凝率的測定方法
　　于200ml燒杯中加入高嶺土懸濁液（1g/l，靜置90min后的上清液 ）93ml，1%CaCl2溶液5ml，發(fā)酵液2ml,用1mol/L的NaOH溶液或1mol/L的HCl溶液將pH值調(diào)至7.0左右。將其放置于磁力攪拌器上攪拌,快速攪拌1min,慢速攪拌2min,靜置15min 后,吸收上清液于721型分光光度計(jì)550nm處測定其吸光度OD550,以高嶺土懸濁液代替發(fā)酵液作對照,以絮凝率表示絮凝活性。絮凝率的計(jì)算公式為：

　　絮凝率(%) =(A-B)/A ×100%

　　式中　　A——對照樣上清液550nm處的吸光度,
　　　　　　B——絮凝后上清液550nm處的吸光度。

1.4 生長曲線的測定
　　在500ml三角瓶內(nèi)裝200ml發(fā)酵培養(yǎng)基，溫度30℃，初始pH為8，以120rpm搖床培養(yǎng)。定時(shí)取樣測定其發(fā)酵液的pH值、菌體生長量（以濁度表示）及絮凝率。
1.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)
　　本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)方法，以絮凝率為控制指標(biāo)，在30℃條件下考察初始pH、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基含糖量及接種量等條件對混合型微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的影響。
　　其試驗(yàn)安排選取L9（34）正交試驗(yàn)表[4]，因素水平見表1。

1.6 溫度對混合型微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的影響
　　在由正交試驗(yàn)所確定的最優(yōu)產(chǎn)絮凝劑的培養(yǎng)條件下，將混合菌型微生物絮凝劑接種于裝有100ml發(fā)酵液的250ml三角瓶中，分別在10℃、30℃、40℃下發(fā)酵培養(yǎng)，分別測定發(fā)酵培養(yǎng)12、24、36、48小時(shí)的絮凝活性。
1.7 混合型微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的絮凝活性的分布
　　將發(fā)酵液以3000rpm離心30min，分別取上清液、菌體（用蒸餾水洗滌后懸浮與上清液等體積的蒸餾水中）和發(fā)酵液測定其絮凝率。以未離心的發(fā)酵液的絮凝率為100％。

2 結(jié)果與討論

2.1篩選結(jié)果
　　本實(shí)驗(yàn)經(jīng)反復(fù)多次篩選得到具有一定絮凝活性的微生物共19株，其中酵母3株，真菌3株和細(xì)菌13株，絮凝活性結(jié)果見表2。

　　將具有絮凝活性的13株細(xì)菌類絮凝劑產(chǎn)生菌進(jìn)行兩兩混合培養(yǎng)，經(jīng)過反復(fù)多次的篩選，篩選出了絮凝活性穩(wěn)定且比單株菌活性高的混合型絮凝劑產(chǎn)生菌（絮凝效果見表3），并命名為MBFH。對該混合型絮凝劑產(chǎn)生菌進(jìn)行形態(tài)觀察可知，其中一株菌（菌名為X9）的菌落呈半透明狀，周邊圓滑，表面光滑濕潤，粘性大。鏡檢時(shí)該菌呈桿狀, 無芽孢，為革蘭氏陽性菌，且在溫度為37℃條件下培養(yǎng)能夠快速生長。另一株菌（菌名為X21）的菌落表面較干燥、不光滑，粘性較小。鏡檢時(shí)該菌呈短桿狀, 無芽孢，為革蘭氏陽性菌，且在溫度為37℃條件下培養(yǎng)生長緩慢。

2.2 MBFH的生長曲線
　　為了解混合菌的生長周期及其與絮凝率變化的關(guān)系，對混合菌MBFH的生長曲線進(jìn)行測定。菌體生長量（OD660）、pH值和絮凝率的關(guān)系如圖1所示。

　　由圖1可知，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，混合菌MBFH在3小時(shí)后進(jìn)入對數(shù)生長期，在16小時(shí)后到達(dá)穩(wěn)定期，此時(shí)絮凝率達(dá)到最大（87％），在此之后緩慢下降并趨于穩(wěn)定。這說明混合菌MBFH具有穩(wěn)定的產(chǎn)絮凝劑能力，并且發(fā)酵液的絮凝率隨菌體生長量的增加同步升高，這表明此混合型微生物絮凝劑的絮凝活性物質(zhì)是由微生物在發(fā)酵過程中生物合成，而非微生物細(xì)胞自溶而產(chǎn)生，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[3]的微生物產(chǎn)絮凝劑的結(jié)果相一致。同時(shí)由圖1還可看出，發(fā)酵液初始pH隨著菌體的生長而迅速下降，并于發(fā)酵培養(yǎng)15小時(shí)后pH降至4.30，隨后趨于穩(wěn)定。這是由于微生物對糖的吸收利用的過程中產(chǎn)酸，也可能是由于微生物絮凝劑本身是酸性的，隨著絮凝劑的不斷產(chǎn)生而使發(fā)酵液的pH值降低。
2.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果
2.3.1 MBFH培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果分析
　　為了考察培養(yǎng)基的初始pH值、含糖量、搖床轉(zhuǎn)速以及接種量對該絮凝劑產(chǎn)生菌的影響，確定其產(chǎn)絮凝劑的最佳條件。根據(jù)正交試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的各種培養(yǎng)條件對MBFH混合菌進(jìn)行培養(yǎng)（同時(shí)做兩組平行），試驗(yàn)結(jié)果見表4。

　　從表4可以看出，培養(yǎng)基初始pH值變化對混合菌MBFH的絮凝活性的影響最大，混合菌MBFH在偏堿性環(huán)境條件下較適于絮凝物質(zhì)產(chǎn)生。而培養(yǎng)基含糖量、搖床轉(zhuǎn)速和相對接種量對絮凝活性影響作用較小。各因素對微生物絮凝劑的絮凝效果的影響程度大小的順序?yàn)椋号囵B(yǎng)基初始pH值>培養(yǎng)基含糖量>相對接種量>搖床轉(zhuǎn)速。由以上四個(gè)因子水平對指標(biāo)均值mi做直觀分析見圖2。由圖可見，pH值為8、搖床轉(zhuǎn)速為120r/min、培養(yǎng)基含糖量為2％、接種量為15％的絮凝率最高。因而絮凝劑產(chǎn)生菌的最佳培養(yǎng)條件是A₃B₁C₂D₃。此條件與正交試驗(yàn)中的產(chǎn)絮凝劑的最佳條件A3B2C1D3相比，搖床轉(zhuǎn)速低，這樣可降低絮凝劑合成的能源消耗。因此本試驗(yàn)將A₃B₁C₂D₃方案確定為最佳培養(yǎng)條件。

2.3.2 溫度對MBFH產(chǎn)絮凝劑的影響
　　由正交條件所確定的最優(yōu)產(chǎn)絮凝劑培養(yǎng)條件，分別在10℃、30℃、40℃下對混合菌MBFH進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定其絮凝活性，其結(jié)果如圖3所示。
　　由圖3可見，溫度對微生物積累絮凝劑有明顯的影響?；旌暇鶰BFH在30℃下的絮凝活性最高，在發(fā)酵培養(yǎng)12小時(shí)之后，絮凝率基本上穩(wěn)定在80％左右。該混合菌在10℃、40℃下的絮凝活性仍較穩(wěn)定，在10℃下在發(fā)酵培養(yǎng)24小時(shí)，絮凝率達(dá)到最大值(60％)；在40℃下在發(fā)酵培養(yǎng)15小時(shí)左右，絮凝活性達(dá)到最大值，絮凝率為53.09％。 因此，溫度為30℃的發(fā)酵培養(yǎng)條件最適于混合菌MBFH產(chǎn)絮凝劑物質(zhì)。發(fā)酵培養(yǎng)的溫度過高或過低都會(huì)影響該混合菌產(chǎn)絮凝劑的能力，溫度過高會(huì)使細(xì)胞組成成分蛋白質(zhì)、核酸等發(fā)生變性，影響細(xì)胞的生長代謝，而溫度過低則使反應(yīng)速度降低，酶活性下降，代謝產(chǎn)物積累時(shí)間延長，不利于絮凝劑的產(chǎn)生。

2.4 MBFH的絮凝活性分布
　　根據(jù)絮凝活性分布試驗(yàn)結(jié)果（見圖4）來看，混合菌MBFH絮凝活性約94.8％存在于上清液中，說明起絮凝作用的物質(zhì)存在于發(fā)酵液中，是由菌體在發(fā)酵過程中產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外而成的；而菌體懸液的絮凝率出現(xiàn)負(fù)值，這是由于菌體懸液具有一定濁度，同時(shí)說明菌體細(xì)胞無絮凝效果，也說明菌體的存在干擾對高嶺土懸液的絮凝效果?；旌暇鶰BFH的發(fā)酵液經(jīng)過4℃、35℃、60℃、80℃、100℃處理30min后測定其絮凝活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（見圖5），當(dāng)熱處理高達(dá)100℃時(shí)，絮凝活性下降至10％。由于某些以蛋白質(zhì)為主要成分的微生物絮凝劑的活性受溫度的影響較大，高溫時(shí)變性，喪失部分絮凝能力[5]，而由多聚糖構(gòu)成的絮凝劑則基本不受溫度的影響[6]。因此推斷該微生物絮凝劑包含一部分熱不穩(wěn)定物質(zhì)，即蛋白質(zhì)類物質(zhì)和一部分熱穩(wěn)定物質(zhì)，為多聚糖類物質(zhì)?；蛘呤怯捎诩訜嵩斐删€狀分子的無規(guī)卷曲導(dǎo)致橋聯(lián)作用的喪失，而電中和作用依然存在。

3 結(jié)論

　?。?）試驗(yàn)結(jié)果表明：從活性污泥中分離篩選出了混合菌MBFH。該混合菌的產(chǎn)絮凝劑的最佳培養(yǎng)條件為：溫度 30℃、初始pH值8.0、搖床轉(zhuǎn)速為120r／min、培養(yǎng)基含糖量為2％、相對接種量為15％；在此條件下，最大絮凝率約為88％。
　?。?）混合菌MBFH培養(yǎng)時(shí)間為16小時(shí)，在此時(shí)間內(nèi)菌體生長量達(dá)到最大，且絮凝活性達(dá)到87％，其所合成的絮凝物質(zhì)主要是由菌體在發(fā)酵過程中產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外而成的。
　　同時(shí)需要指出的是，此混合型微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的菌種鑒定及其菌種的混合比例有待進(jìn)一步的深入研究。

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作者簡介：李霞，女，1979?，F(xiàn)就讀四川大學(xué)環(huán)境工程研究生，主要從事水污染控制方向。