給水管道生物膜中的細(xì)菌生長研究

于水利*　 余鑫晶　 邱曉霞
Yu Shuili　 Yu Xinjing　 Qiu Xiaoxia

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政環(huán)境工程學(xué)院 150090）
（School of Municipal and Environmental Engineering，Harbin Institute of Technology，P.R.China，150090）

摘要：近年來，人們越來越關(guān)注飲用水在管道中的二次污染問題，并提出了飲用水質(zhì)的生物穩(wěn)定性概念。本文用生物學(xué)方法分析了給水管網(wǎng)生物膜中細(xì)菌的種群生長情況。PCR擴(kuò)增、凝膠電泳試驗(yàn)檢測結(jié)果表明，試驗(yàn)管道和哈爾濱自來水管道生物膜中不含銅綠假單胞菌。從拍攝的掃描電鏡可以看出，附著在管壁上的微生物多為球菌和桿菌。從模型管網(wǎng)分離出20株菌，其中玫瑰色微球菌、藤黃微球菌、地桿菌屬、擴(kuò)展短桿菌、節(jié)桿菌屬是模型管道試驗(yàn)的優(yōu)勢菌。輸送同一水質(zhì)的哈爾濱市實(shí)際管網(wǎng)管壁生物膜中的細(xì)菌種類與模型管道中的類似。

關(guān)鍵詞：飲用水生物穩(wěn)定性、優(yōu)勢菌種、分菌、PCR擴(kuò)增、銅綠假單胞菌

Abstract: The recontamination during distribution of drinking water has been receiving considerable attention these years. Microbiological method wad used to analyze the population of the biofilms. Pseudomonas aeruginosa was not found in the biofilms by the PCR amplification and agarose gel eletrophoresis. According to the scanning electron microscopic photos, most microorganisms attached inside pipelines were found to be cocci and bacilli. 20 bacteria strains were obtained. For the model pipeline, the dominant species living throughout the test periods were Micrococcus Roseus, Micrococcus luteus, Terrabacter Collins, Brevibacterium linens and Arthrobacter. The strains of the actual pipeline was similar with the model pipeline.

Key words: Biostability of drinking water, Dominant species, Isolation, PCR reactions, Pseudomonas aeruginosa.

0 前言

　　近年來，人們越來越關(guān)注飲用水在管道中的二次污染問題，并提出了飲用水質(zhì)的生物穩(wěn)定性概念。飲用水生物穩(wěn)定性（biological stability of drinking water）是指飲用水中可生物降解有機(jī)物支持異養(yǎng)菌生長的潛力，即當(dāng)有機(jī)物成為異養(yǎng)菌生長的限制因素時(shí)，水中有機(jī)營養(yǎng)物支持細(xì)菌生長的最大可能性。飲用水生物穩(wěn)定性高，表明水中細(xì)菌生長所需的有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)含量低，細(xì)菌不易在其中生長；反之，飲用水生物穩(wěn)定性低，則表明水中細(xì)菌生長所需的有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)含量高，細(xì)菌容易在其中生長^[1]。
　　 研究控制給水管網(wǎng)中細(xì)菌再生長成為提高水質(zhì)生物穩(wěn)[3]定性的關(guān)鍵。本文采用生物學(xué)方法，對給水管網(wǎng)管壁中形成的生物膜進(jìn)行分菌、純化試驗(yàn)，分析生物膜中的細(xì)菌生長情況，找出給水管道生物膜中的優(yōu)勢菌，尋找從根本上提高飲用水管道的生物穩(wěn)定性的方法。由于傳統(tǒng)的細(xì)菌分菌方法具有一些局限性，難以保證分離一些量少或不容易存活的細(xì)菌，本文用分子生物學(xué)方法，檢測某些病原菌或有特定研究意義的菌種。文獻(xiàn)[2]曾報(bào)導(dǎo)在飲用水中發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌（綠膿桿菌）的存在，它是一種機(jī)會(huì)致病菌，對人體會(huì)產(chǎn)生一定的危害。因此，本文嘗試用PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）擴(kuò)增及凝膠電泳的方法來檢測給水管網(wǎng)生物膜中是否有銅綠假單胞菌的存在。PCR擴(kuò)增檢測具有快速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，可以推廣應(yīng)用于檢測水中病原菌的試驗(yàn)中。

1 試驗(yàn)設(shè)備與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)備
　　管道生物膜在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室管道模型中培養(yǎng)，管道長0.4m，內(nèi)徑150mm，模型的示意圖見圖1。管道材質(zhì)采用鑄鐵管，管上有6個(gè)取樣口，用套有相同鑄鐵片的螺栓擰在模型上，鑄鐵片即為模擬的管壁，在其上培養(yǎng)生物膜。
　　 該模型連接在自來水管道上，自來水的水質(zhì)情況如表1所示。

實(shí)驗(yàn)室自來水水質(zhì)（哈爾濱市）　　　　　　　　 表1

　　模型從2004年3月起開始運(yùn)行，于2004年7月（培養(yǎng)4個(gè)月）、11月（培養(yǎng)8個(gè)月）與2005年3月（培養(yǎng)12個(gè)月）分別取樣進(jìn)行分菌純化鑒定試驗(yàn)。另外于2005年5月對實(shí)際管網(wǎng)（檢修時(shí)）取樣進(jìn)行分菌純化鑒定分析。

圖1實(shí)驗(yàn)室管道模型示意圖

1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 分菌
　　取樣：無菌操作，用一小團(tuán)滅菌的脫脂棉輕輕擦拭在鑄鐵片上形成的生物膜，立即投入盛有100ml無菌水的錐形瓶中，塞上棉塞，用力震蕩約15分鐘，使脫脂棉上的菌膠團(tuán)充分打散。
　　增菌：對水樣用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液分別作好氧菌和厭氧菌的增菌培養(yǎng)，好氧30℃，48小時(shí)，厭氧30℃，4天。模型管網(wǎng)的第三批水樣進(jìn)行了增菌處理，同時(shí)也作了不增菌的平行樣，之后進(jìn)行分菌。
　　分菌：取增菌后的培養(yǎng)液進(jìn)行逐倍稀釋，用涂布與混合法在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌落，30℃培養(yǎng)1~7天，對長出的不同菌落進(jìn)行劃線分離。
　　純化：對分離出的菌落進(jìn)行多次劃線分離純化，劃線4~5次后基本可以確定為純菌，將純菌轉(zhuǎn)移到斜面平板上保存并分析。
　　鑒定：細(xì)菌鑒定按文獻(xiàn)[3]所描述的水中常見細(xì)菌的生理生化鑒定方法，從以下幾個(gè)主要生化特性對細(xì)菌進(jìn)行鑒定：革蘭氏染色；淀粉水解；接觸酶試驗(yàn)；產(chǎn)吲哚；產(chǎn)硫化氫；硝酸鹽還原；葡萄糖發(fā)酵；V.P和需氧性。鑒定依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》^[4]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》^[5]?！恫芗?xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對細(xì)菌的形態(tài)、生理生化特性和營養(yǎng)需求等均有詳細(xì)的描述，是細(xì)菌分類鑒定的重要參考書。
1.2.2 電子顯微技術(shù)
　　對分離出的幾個(gè)菌種拍攝透射電鏡，以便更好的觀察菌種的形狀。
　　對管道生物膜拍攝掃描電鏡，以便直觀的觀察生物膜的生長狀況。
1.2.3 PCR擴(kuò)增
　　聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是一種對特定的DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的新方法。該方法一改傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù)的模式，不通過活細(xì)胞，操作簡便，在數(shù)小時(shí)內(nèi)可使幾個(gè)拷貝的模版序列甚至一個(gè)DNA分子擴(kuò)增10⁷~10⁸倍，大大提高了DNA的得率。作為檢測手段的PCR技術(shù)，成敗的關(guān)鍵在于選擇合適的靶序列，使其產(chǎn)物具有所需要的特異性，而其產(chǎn)物能否具有特異性，又取決于引物的設(shè)計(jì)。不同的試驗(yàn)所需要擴(kuò)增的DNA片段也可能不同，因此設(shè)計(jì)的引物也不一定相同。
　　目前已經(jīng)有很多用PCR檢測銅綠假單胞菌的實(shí)例，臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用相對較多。K.P.Song^[6]用外毒素A（ETA）特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對眼科疾病患者檢測是否受到銅綠假單胞菌的感染；Ferenc Karpati^[7] 用PCR對部分16S rRNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，檢測患囊腫性纖維化的病人受到銅綠假單胞菌的感染；Gareth Lloyd-Jones^[8] 用熒光PCR對新西蘭的土壤中的銅綠假單胞菌進(jìn)行量化分析；Nicola M.Kingsford^[9]用PCR對部分16S rRNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，檢測出羊毛廢水含有銅綠假單胞菌。由于銅綠假單胞菌的ETA基因是唯一的，且在所有的銅綠假單胞菌菌株中均能存在，具有很強(qiáng)的專屬性。因此本次實(shí)驗(yàn)也采用文獻(xiàn)[6]中的引物，由上?；瞪镉邢薰竞铣?，引物序列如下：

1, 5 -GAC AAC GCC CTC AGC ATC ACC AGC-3

2, 5 -CGC TGG CCC ATT CGC TCC AGC GCT-3

　　實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了5個(gè)樣，T為銅綠假單胞菌純菌培養(yǎng)液，R1、R2為實(shí)際管網(wǎng)水樣，M1、M2為模型管網(wǎng)水樣。其中R1、R2、M1、M2水樣取法同分菌試驗(yàn)，再用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液在35℃下富集48小時(shí)（銅綠假單胞菌在該富集培養(yǎng)液中能夠很好的生存繁殖），為避免培養(yǎng)液中因目標(biāo)菌株量少而導(dǎo)致DNA提取失敗，本實(shí)驗(yàn)直接用培養(yǎng)液進(jìn)行PCR擴(kuò)增與凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。PCR擴(kuò)增體系如下：
　　總體積：12.5ul；EXtag：0.2ul（5U/ul）；10x PCR buffer（含鎂離子）：1.25ul；2.5m M的DNTP：1ul；Primer：0.25ul（each,20m M）；菌液：1ul；DdH₂O：8.55ul。PCR反應(yīng)條件如下：（a）預(yù)變性：95℃下，18min；（b）三溫循環(huán)法：95℃下，15s，54℃下，1min，72℃下，1min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；（c）結(jié)束：72℃下，10min。電泳所用的膠為瓊脂糖凝膠（1%），EB染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)結(jié)果
2.1.1 分菌結(jié)果
　　本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型管網(wǎng)三次分菌純化鑒定試驗(yàn)共得到20種不同的菌株，對三次試驗(yàn)依次編號1、2、3，其中樣3平行增菌的水樣編號3’，實(shí)際管網(wǎng)分菌試驗(yàn)編號4，試驗(yàn)結(jié)果見表2。各個(gè)菌株的部分生理生化結(jié)果見表3，其他幾項(xiàng)生理生化試驗(yàn)結(jié)果差別不大并對鑒定沒有決定性的作用，只作為鑒定的參考，因此并未列出。
　　從鑒定結(jié)果不難看出，從給水管壁生物膜中分離出的細(xì)菌均為化能異養(yǎng)菌，多為革蘭氏陽性菌，好氧或者兼性厭氧且桿菌較多。由于傳統(tǒng)的生理生化試驗(yàn)考察的菌株特性有限，所以部分菌株只能鑒定到屬，如果要進(jìn)一步作準(zhǔn)確地鑒定，可以結(jié)合PCR擴(kuò)增、DNA測序等較新的技術(shù)進(jìn)行測定。

模型管網(wǎng)分菌結(jié)果　　　　　　　　　　 表2

各菌株的生理生化特性　　　　　　　 　　　表3

2.1.2 透射電鏡
　　由于細(xì)菌個(gè)體較小，利用一般的光學(xué)顯微鏡觀察不夠清晰，為此，挑選幾種菌株拍攝了透射電鏡，它們的形態(tài)在本次分菌試驗(yàn)中具有一定的代表性，本次試驗(yàn)對玫瑰色微球菌、反硝化利斯特氏菌、節(jié)桿菌、擴(kuò)展短桿菌進(jìn)行透射電鏡拍攝觀察，結(jié)果見圖2所示。
　　從透射電鏡照片可以清楚地看到菌株單個(gè)細(xì)胞的形態(tài)及附屬物，細(xì)胞的組合方式等。圖2中的玫瑰色微球菌為球形，四聯(lián)排列；反硝化利斯特氏菌細(xì)胞幼菌為端圓短桿，老菌呈長桿狀，長有周生鞭毛；節(jié)桿菌老期培養(yǎng)物幾乎都是球狀菌，且大小不一 ，在較大的球狀細(xì)胞中，可能從細(xì)胞的兩個(gè)，三個(gè)或罕有從四個(gè)部位長出突起，該特點(diǎn)與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》對節(jié)桿菌的描述一致，是節(jié)桿菌鑒定的重要特征；擴(kuò)展短桿菌幼菌呈長的不規(guī)則桿狀，單個(gè)或成對，老菌為球狀。

2.1.3 掃描電鏡
　　為了對管壁生物膜進(jìn)行更直觀地觀察，于2005年3月對1號口進(jìn)行取樣拍攝掃描電鏡，觀察管壁生物膜的生長情況電鏡照片如圖3所示。
　　從掃描電鏡照片中可以看出，管壁表面已經(jīng)形成了管垢，管垢中有許多大小不均一的孔隙，為細(xì)菌的附著生長進(jìn)而形成生物膜提供了條件，生物膜中附著有大量的球菌和桿菌及其菌膠團(tuán)。這為致病菌的附著生長提供了很好的環(huán)境。管道中的水壓或水流流速變化使管壁上的生物膜被沖刷，就很容易導(dǎo)致水中細(xì)菌數(shù)增多及致病菌的爆發(fā)，因此該管道水存在細(xì)菌爆發(fā)的潛在危機(jī)。

2.1.4 PCR擴(kuò)增結(jié)果
　　PCR擴(kuò)增后的凝膠電泳照片如圖4所示。泳道1、2在II、III之間有一條特異擴(kuò)增條帶，為陽性，其他樣品及空白泳道無條帶顯示，為陰性。實(shí)驗(yàn)中特別設(shè)計(jì)了銅綠假單胞菌純菌樣品（T，由黑龍江省微生物研究所提供，菌株編號為ATCC 27853）同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，為陽性結(jié)果，這就說明設(shè)計(jì)的引物對銅綠假單胞菌是具有特異擴(kuò)增效果的，排除了其他樣品因非特異擴(kuò)增而產(chǎn)生的陰性結(jié)果產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)論。從結(jié)果可以說明管道的幾個(gè)水樣R1、R2、M1、M2不存在銅綠假單胞菌。

2.2 試驗(yàn)結(jié)果分析
　　從鑒定結(jié)果不難看出，從給水管壁生物膜中分離出的細(xì)菌均為化能異養(yǎng)菌，多為革蘭氏陽性菌，好氧或者兼性厭氧且桿菌較多。其中玫瑰色微球菌、藤黃微球菌、地桿菌屬、擴(kuò)展短桿菌、節(jié)桿菌屬在管道模型三次試驗(yàn)中均分離得到，說明這幾種菌在模型管道管壁的生物膜上一直存在，已經(jīng)適應(yīng)了管道的貧營養(yǎng)環(huán)境，是該次模型管道試驗(yàn)的優(yōu)勢菌。根據(jù)文獻(xiàn)[4]對這些優(yōu)勢菌營養(yǎng)要求的描述，發(fā)現(xiàn)這兩種球菌的生長依賴于乙酸，乳酸鹽，丙酮酸鹽，琥珀酸鹽，甘油和碳水化合物（特別是葡萄糖）；這幾種桿菌的營養(yǎng)要求更為復(fù)雜，碳水化合物，糖類，脂肪酸，二羧酸，羥酸，乙二醇，氨基酸，雜環(huán)化合物等等都是它們能夠利用的營養(yǎng)物質(zhì)。因此，從徹底去除細(xì)菌所需的營養(yǎng)物質(zhì)角度來控制管道中的細(xì)菌再生長有一定的難度，需要在各個(gè)工藝上加強(qiáng)這些營養(yǎng)物質(zhì)的去除效果。
　　從第三批經(jīng)過增菌試驗(yàn)的樣品共分出三種菌株，可以推斷這三種菌株在營養(yǎng)豐富的條件下繁殖較快，很快的在培養(yǎng)液里占據(jù)了優(yōu)勢，而其他在不增菌條件下分離得到的其他菌株可能不適應(yīng)富營養(yǎng)條件的培養(yǎng)液，被逐漸淘汰，因此未在增菌試驗(yàn)的分菌試驗(yàn)中得到。這些是只適應(yīng)管道貧營養(yǎng)生長環(huán)境的菌種，在研究管道生物時(shí)應(yīng)該予以重視。另外，擴(kuò)展短桿菌在增菌或不增菌試驗(yàn)中均存在，說明該菌的適應(yīng)能力較強(qiáng)，既能適應(yīng)管道的貧營養(yǎng)生長環(huán)境也能適應(yīng)富營養(yǎng)生長環(huán)境。
　　從實(shí)際管網(wǎng)的分菌結(jié)果看出，實(shí)際管網(wǎng)管壁生物膜中生長的細(xì)菌種類與模型管道中的類似，由于模型管道與實(shí)際管網(wǎng)輸送的是同一水質(zhì)的水，因此可以推斷長期輸送該水質(zhì)管道的管壁上容易滋生這些類型的細(xì)菌。雖然這些細(xì)菌不是致病菌，但是管壁上大量細(xì)菌的附著與繁殖有利于某些機(jī)會(huì)病原菌的滋生，一旦管道中的水流速度、壓力發(fā)生變化沖刷管壁形成的生物膜就容易導(dǎo)致水中病原菌的爆發(fā)，危害人類健康。
　　從拍攝的模型管網(wǎng)掃描電鏡照片可以看出，管壁表面已經(jīng)形成了管垢，管垢中有許多大小不均一的孔隙，為細(xì)菌的附著生長進(jìn)而形成生物膜提供了條件，生物膜中附著有大量的球菌和桿菌及其菌膠團(tuán)。這為致病菌的附著生長提供了很好的環(huán)境。管道中的水壓或水流流速變化使管壁上的生物膜被沖刷，就很容易導(dǎo)致水中細(xì)菌數(shù)增多及致病菌的爆發(fā)，因此該管道水存在細(xì)菌爆發(fā)的潛在危機(jī)。
　　從PCR擴(kuò)增檢測銅綠假單胞菌的結(jié)果說明此次試驗(yàn)的模型管網(wǎng)與實(shí)際管網(wǎng)中并不存在銅綠假單胞菌，目前較為安全。

3 結(jié)論

　　（1）從模型管網(wǎng)（運(yùn)行一年）的掃描電鏡照片可以看出，管壁表面已經(jīng)形成了管垢，管垢中有許多大小不均一的孔隙，為細(xì)菌的附著生長進(jìn)而形成生物膜提供了條件，生物膜中附著有大量的球菌和桿菌及其菌膠團(tuán)。這為致病菌的附著生長提供了很好的環(huán)境。管道中的水壓或水流流速變化使管壁上的生物膜被沖刷，就很容易導(dǎo)致水中細(xì)菌數(shù)增多及致病菌的爆發(fā)，因此該管道水存在細(xì)菌爆發(fā)的潛在危機(jī)。
　　（2）從鑒定結(jié)果不難看出，從給水管壁生物膜中分離出的細(xì)菌均為化能異養(yǎng)菌，多為革蘭氏陽性菌，好氧或者兼性厭氧且桿菌較多。其中玫瑰色微球菌、藤黃微球菌、地桿菌屬、擴(kuò)展短桿菌、節(jié)桿菌屬在管道模型三次試驗(yàn)中均分離得到，說明這幾種菌在模型管道管壁的生物膜上一直存在，已經(jīng)適應(yīng)了管道的貧營養(yǎng)環(huán)境，是該次模型管道試驗(yàn)的優(yōu)勢菌。
　?。?）根據(jù)這些優(yōu)勢菌的營養(yǎng)要求，我們發(fā)現(xiàn)玫瑰色微球菌、藤黃微球菌的生長依賴于乙酸，乳酸鹽，丙酮酸鹽，琥珀酸鹽，甘油和碳水化合物（特別是葡萄糖）；地桿菌屬、擴(kuò)展短桿菌、節(jié)桿菌屬的營養(yǎng)要求更為復(fù)雜，碳水化合物，糖類，脂肪酸，二羧酸，羥酸，乙二醇，氨基酸，雜環(huán)化合物等等都是它們能夠利用的營養(yǎng)物質(zhì)。因此，從徹底去除細(xì)菌所需的營養(yǎng)物質(zhì)角度來控制管道中的細(xì)菌再生長有一定的難度，需要在各個(gè)工藝上加強(qiáng)這些營養(yǎng)物質(zhì)的去除效果。
　　（4）從第三批經(jīng)過增菌試驗(yàn)的分菌結(jié)果看出，共分出三種菌株，可以推斷這三種菌株在營養(yǎng)豐富的條件下繁殖較快，很快的在培養(yǎng)液里占據(jù)了優(yōu)勢，而其他在不增菌條件下分離得到的其他菌株可能不適應(yīng)富營養(yǎng)條件的培養(yǎng)液，被逐漸淘汰，因此未在增菌試驗(yàn)的分菌試驗(yàn)中得到。這些是只適應(yīng)管道貧營養(yǎng)生長環(huán)境的菌種，在研究管道生物時(shí)應(yīng)該予以重視。另外，擴(kuò)展短桿菌在增菌或不增菌試驗(yàn)中均存在，說明該菌的適應(yīng)能力較強(qiáng)，既能適應(yīng)管道的貧營養(yǎng)生長環(huán)境也能適應(yīng)富營養(yǎng)生長環(huán)境。
　?。?）從實(shí)際管網(wǎng)的分菌結(jié)果看出，實(shí)際管網(wǎng)管壁生物膜中生長的細(xì)菌種類與模型管道中的類似，由于模型管道與實(shí)際管網(wǎng)輸送的是同一水質(zhì)的水，因此可以推斷長期輸送該水質(zhì)管道的管壁上容易滋生這些類型的細(xì)菌。雖然這些細(xì)菌不是致病菌，但是管壁上大量細(xì)菌的附著與繁殖有利于某些機(jī)會(huì)病原菌的滋生，一旦管道中的水流速度、壓力發(fā)生變化沖刷管壁形成的生物膜就容易導(dǎo)致水中病原菌的爆發(fā)，危害人類健康。
　?。?）從PCR擴(kuò)增檢測銅綠假單胞菌的結(jié)果看出，此次試驗(yàn)的模型管網(wǎng)與實(shí)際管網(wǎng)中并不存在銅綠假單胞菌，目前較為安全。PCR擴(kuò)增方法簡便快速，可以針對某一菌種進(jìn)行快速檢測，比起傳統(tǒng)的生物學(xué)方法具有很大的優(yōu)越性，值得推廣。

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*通訊作者：于水利：Email:ysl@hit.edu.cn
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