譚文捷1,李發(fā)生2*,杜曉明2,谷慶寶2,何緒文1

(1.中國礦業(yè)大學(xué)(北京校區(qū))化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,北京　100083;
2.中國環(huán)境科學(xué)研究院土壤污染與控制研究室,北京　100012)

　　摘要:用解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)作為試驗菌種,對除草劑丁草胺(N-丁氧甲基氯-2′-氯-2′,6′-二乙基乙酰替苯胺)在水介質(zhì)中的微生物降解進行了研究。篩選了解淀粉芽孢桿菌降解丁草胺的最佳試驗條件,研究了不同初始pH和添加外源腐殖酸對丁草胺微生物降解的影響。用高效液相色譜法(HPLC)檢測了丁草胺殘留量和降解產(chǎn)物,用紅外光譜法(FTIR)分析測定了反應(yīng)前后腐殖酸的變化情況。結(jié)果表明:解淀粉芽孢桿菌對丁草胺具有明顯的降解效果,丁草胺初始質(zhì)量濃度越高,其降解速率和降解效率也越高,堿性條件下丁草胺的降解率明顯比酸性條件下高;腐殖酸的加入不僅能吸附丁草胺還能促進細菌對丁草胺的微生物降解,并能影響丁草胺的微生物降解產(chǎn)物。

　　關(guān)鍵詞:解淀粉芽孢桿菌;丁草胺;腐殖酸;生物降解

　　中圖分類號:X592　　　文獻標識碼:A　　　文章編號:1001-6929(2005)03-0071-04

Biodegradation of Herbicide Butachlor in Water Media UsingBacillus amyloliquefaciens

TANWen-jie1, LI Fa-sheng2, DUXiao-ming2, GUQing-bao2, HE Xu-wen1

(1.School of Chemical and Environmental Engineering, China University of Mining&Technology, Beijing　100083, China;
2.Department of Soil Pollution Control, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing　100012, China)

Abstract: Biodegradation of herbicide butachlor (N-butoxymethyl-2′-chloro-2′, 6′-diethy lacetanilide) in aqueous media usingBacillus
amyloliquefacienswas investigated. The conditions for butachlor biodegradation were optimized. Effects of different initial pH values and addition of humic acids (HAs) on biodegradation of butachlorwere studied. The variation of butachlor residues and biodegradation productswas analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). The change of HAs under different reaction conditions was determined by fourier transform infra red (FTIR) spectroscopy. It was demonstrated thatBacillus amyloliquefacienscan degrade butachlor efficiently. Degradation rate increased with the initial concentrations of the tested herbicide and media pH. The addition of exogenous HAs can enhance the adsorption of butachlor, accelerate the biodegradation process of butachlor, and affect the biodegradation products in the meantime.
Key words:Bacillus amyloliquefaciens; butachlor; humic acids; biodegradation

　　丁草胺(N-丁氧甲基氯-2′-氯-2′,6′-二乙基乙酰替苯胺)是一種高效的選擇性芽前除草劑。目前丁草胺已成為中國和世界水稻田首選的除草劑與殺稗劑之一^[1]。丁草胺的大量使用必然會對環(huán)境產(chǎn)生一定的影響。丁草胺在自然界降解較快,其降解一般是依賴微生物和化學(xué)反應(yīng)的共同作用^[2]。已有的研究表明,丁草胺水解速度很慢^[3],光穩(wěn)定性好^[4],不易被紫外線分解。環(huán)境中丁草胺的降解主要是由于微生物作用[5-6]所致。筆者采用從土樣中分離純化出來的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)作為試驗菌種,研究丁草胺在水介質(zhì)中的微生物降解過程,篩選解淀粉芽孢桿菌降解丁草胺的最佳試驗條件,研究初始pH和添加外源腐殖酸等對丁草胺微生物降解過程的影響。

　　1　材料與方法

　　1.1　材料

　　土樣采自北京市昌平區(qū)水稻田,丁草胺標樣購于國家農(nóng)藥質(zhì)檢中心,其質(zhì)量分數(shù)為93.1%?；A(chǔ)培養(yǎng)液:0.2 g MgSO4·7H2O, 0·001 g FeSO4·7H2O, 0·1gK2HPO4,0·1 g (NH4)2SO4和0·04 g CaSO4,加重蒸餾水至1 L,pH調(diào)至7·0。腐殖酸是采用標準方法[7]從北京水稻土中提取的,所用菌種是從北京水稻土中分離純化出來的。經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
　
　　解淀粉芽孢桿菌形態(tài)特征:革蘭氏陽性;菌體桿狀、形成芽孢,芽孢卵圓形,孢囊膨大;最適生長溫度為28~30℃。生理生化性質(zhì):還原硝酸鹽;水解淀粉;可發(fā)酵D-葡萄糖,L-阿拉伯糖,甘露醇,D-木糖;接觸酶陽性;氧化酶陰性。

　　圖1為自土壤中提取的解淀粉芽孢桿菌顯微觀察照片。其中,圖1(a)為放大1500倍條件下革蘭氏染色后的光學(xué)顯微鏡照片,圖1(b)為細菌的掃描電鏡照片。圖1(b)中,桿狀的為菌體,長度約為3μm;卵圓形膨大的是芽孢,體型較小。

　　1.2　主要儀器和設(shè)備

　　 YXQG01型蒸汽滅菌鍋;HITACHI D-2500型高效液相色譜儀,帶L-4200型紫外檢測器;FTIR紅外光譜儀(Nicolet 5PC,software Omnic1.2b);HZQ-C空氣浴振蕩器;HITACHI S-570掃描電子顯微鏡和BH-A型光學(xué)顯微鏡。

　　1.3　操作方法

　　反應(yīng)液的配制:取2 mL 1 g/L的丁草胺儲備液加入到裝有10 mL制備好的菌懸母液的100 mL容量瓶中,用基礎(chǔ)培養(yǎng)基定容后轉(zhuǎn)移到250 mL錐形瓶中,用0.1 mol/L的鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的pH(依次為5,6,7,8和9)。將錐形瓶放入空氣浴搖床中,控制溫度30℃避光培養(yǎng),間隔一定時間取樣。將取出的樣品過0·45μm濾膜后,用高效液相色譜法測定丁草胺質(zhì)量濃度隨時間的變化情況,檢測波長為215 nm,靈敏度為0.02 AUFS,色譜柱為Hypersil BDS C18(5μm) 4.0mm×200 mm,流動相為V(乙腈)∶V(水)=90∶10,流速為1 mL/min,進樣量10μL。該條件下,丁草胺的保留時間為4.3 min。分析方法的線性范圍為0·1~20mg/L,相關(guān)系數(shù)為0.999。反應(yīng)一段時間后,用HPLC檢測降解產(chǎn)物。

　　2　結(jié)果與討論

　　2.1　初始質(zhì)量濃度對丁草胺微生物降解的影響圖2是不同初始質(zhì)量濃度的丁草胺對微生物降解率的影響。從圖2可以看出,丁草胺初始質(zhì)量濃度較低時的降解率明顯低于初始質(zhì)量濃度高的情況,且開始時降解較快,降解率較高。6 d后降解率變化不明顯,可能是由于微生物數(shù)量的減少,使丁草胺的降解減慢。由于各初始質(zhì)量濃度對微生物的降解都很明顯,因此選取20 mg/L作為后續(xù)試驗質(zhì)量濃度。

　　2.2　不同細菌接種量對丁草胺微生物降解的影響圖3是不同細菌接種量對丁草胺微生物降解的影響。從圖3可以看出,隨著細菌接種量的增加,丁草胺的降解率逐漸增加,當細菌接種量為5和10 mL時,其降解率變化不明顯。因此,試驗選取5 mL作為最佳接種量。

　　 2.3　初始pH對丁草胺微生物降解的影響

　　 表1是丁草胺在不同初始pH水體中的微生物降解動力學(xué)試驗結(jié)果。線性回歸分析表明,在不同pH水體中,丁草胺的微生物降解反應(yīng)均遵從一級反應(yīng)動力學(xué)方程,回歸分析的相關(guān)系數(shù)均在0·9以上,符合農(nóng)藥生物降解的一般規(guī)律[2]。從表1可以看出,水溶液的堿性越強,微生物降解的速率越快;酸性越強,降解速度越慢。

表1　丁草胺在不同初始pH水體中的微生物降解動力學(xué)
Table 1　The kinetic results of biodegradation of butachlor under different initial pH

初始pH	回歸方程	相關(guān)系數(shù)(R)	半衰期(t1/2)/d
5	C=9.5238e-0.1604t	0.9884	4.0
6	C=10.912e-0.2044t	0.9794	3.8
7	C=8.7147e-0.2415t	0.9554	2.3
8	C=9.5571e-0.3805t	0.9202	1.7
9	C=10.617e-0.4844t	0.9494	1.5

　　注:C為丁草胺質(zhì)量濃度,mg/L;t為采樣時間,d。

　　 將不同pH水體中丁草胺的殘留量隨時間的變化規(guī)律繪制成圖4。從圖4可以看出,隨著堿性的增強,丁草胺的殘留質(zhì)量濃度下降速率明顯加快,且最終降解率較高。說明在酸性條件下,丁草胺微生物降解速率緩慢;而在堿性條件下,其降解速率較快。

　　2.4　腐殖酸對丁草胺微生物降解的影響

　　 圖5為在加入腐殖酸的水體中丁草胺降解殘留量變化情況。由圖5可以看出,在空白水體中,丁草胺水解速度緩慢。在添加腐殖酸的水體中,腐殖酸對丁草胺的吸附在2 d后達到平衡,平衡后丁草胺殘留質(zhì)量濃度變化緩慢。在接種微生物的水體中,丁草胺的降解速率明顯比水解速度快,說明丁草胺的降解主要是微生物降解。而在接種微生物的水體中加入腐殖酸,使丁草胺的質(zhì)量濃度迅速下降,是所有對比樣中質(zhì)量濃度最低的。說明腐殖酸對丁草胺的微生物降解有很大的促進作用。原因可能是加入的腐殖酸除了發(fā)揮吸附作用外,還充當了一種表面活性物質(zhì)的作用,加速了丁草胺在水溶液中的分散,使微生物與丁草胺充分接觸并得到降解;另一種可能是加入的腐殖酸作為一種載體,在吸附丁草胺的同時,也吸附微生物,細菌附著在腐殖酸的表面形成生物膜,增加了細菌與丁草胺接觸的可能,從而加速其降解。

　　 將不同反應(yīng)條件下的腐殖酸進行紅外分析,得到圖6,各吸收峰的歸屬[8-10]見表2。由于腐殖酸吸附丁草胺的量較低,吸附前后紅外光譜的變化不十分明顯,即圖6中曲線a,b和c出現(xiàn)吸收峰的波數(shù)大致相同,峰面積相近。但在波數(shù)為2 855和1 385 cm-1附近,圖6中3條曲線的峰面積有明顯的差異,即吸附丁草胺后在該波數(shù)的吸收峰面積明顯增加。1 657 cm-1代表C O伸縮振動吸收峰,而1 035 cm-1代表C—O的變形振動吸收峰,面積變小說明該基團受到干擾,即吸附后腐殖酸的羰基(C O)及酚醇羥基(O—H)與丁草胺形成氫鍵。說明形成氫鍵是腐殖酸吸附丁草胺的主要作用。曲線c與b相比,在2 855 cm-1處出現(xiàn)明顯的吸收峰,在1 385 cm-1處吸收峰明顯增強,說明在該波數(shù)處腐殖酸對反應(yīng)物有明顯的吸附作用,微生物的加入對腐殖酸的吸附作用影響不大。

　　 2.5　產(chǎn)物分析

　　 2.5.1　丁草胺的微生物降解產(chǎn)物

　　用高效液相色譜法檢測丁草胺微生物降解產(chǎn)物(見圖7),發(fā)現(xiàn)在該試驗時間范圍內(nèi),除峰1為丁草胺母體外,還出現(xiàn)了5個主要產(chǎn)物峰,分別為峰2~6。說明丁草胺的微物生降解產(chǎn)物不是單一的,具有多樣性。

　　 2.5.2　添加腐殖酸后丁草胺的微生物降解產(chǎn)物圖8是添加腐殖酸后丁草胺微生物降解的HPLC結(jié)果。與圖7相比,圖8中產(chǎn)物峰的峰型和數(shù)量都存在明顯差異,缺少圖7中峰5和峰6兩種產(chǎn)物,但又增加了一種新的產(chǎn)物(峰7);而且丁草胺的峰面積也比圖7中的小得多,這是由于腐殖酸對丁草胺的吸附作用所致。比較圖7,8表明,腐殖酸不僅能吸附丁草胺,加速丁草胺的微生物降解過程,而且還能影響丁草胺的微生物降解產(chǎn)物,其機理還有待于進一步研究。

　　3　結(jié)論

　　a.在解淀粉芽孢桿菌-丁草胺微生物降解體系中,不同pH條件下丁草胺的微生物降解反應(yīng)遵從一級反應(yīng)動力學(xué)方程,水體的堿性越強,微生物的降解速率越快;酸性越強,降解速率越慢。

　　b.在解淀粉芽孢桿菌-丁草胺體系中,腐殖酸的加入能加速丁草胺的微生物降解。原因可能是加入的腐殖酸除了發(fā)揮吸附作用外還充當了一種表面活性物質(zhì)的作用,加速了丁草胺在水溶液中的分散,使得微生物與丁草胺充分接觸并得以降解;另一種可能是加入的腐殖酸作為一種載體,在吸附丁草胺的同時,也吸附微生物,細菌附著在腐殖酸的表面形成生物膜,增加了細菌與丁草胺接觸的可能性,從而加速其降解。c.高效液相色譜分析結(jié)果表明,腐殖酸不僅能加速丁草胺的微生物降解過程,而且還能影響丁草胺的微生物降解產(chǎn)物。

參考文獻:
[1]　唐除癡.農(nóng)藥化學(xué)[M].天津:南開大學(xué)出版社,1998.Tang Chuchi.Pesticide chemistry[M].Tianjin:Nankai University Press,1998.
[2]　夏北成.環(huán)境污染物生物降解[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2002.Xia Beicheng. Biodegradation of contamination in environment [M].Beijing:Chemical Industry Press,2002.
[3]　姚斌,徐建民,張超蘭.除草劑丁草胺的環(huán)境行為綜述[J].生態(tài)環(huán)境,2003,12(1):66-70.Yao Bin,Xu Jianmin,Zhang Chaolan.Behavior of herbicide butachlor in environment[J].Ecology and Environment,2003,12(1):66-70.
[4]　Zheng H,Ye C.Photodegration of acetochlor and butachlor in waters containing humic acid and inorganic ion [J]. Bull Environ Contam Toxicol,2001,67:601-608.
[5]　Yu Y L,Chen Y X,Luo Y M.Rapid degradation of butachlor in wheat rhizosphere soil[J].Chemosphere,2003,50:771-774.
[6]　Chen Y L,Wu T C.Degradation of herbicide butachlor by soil microbes[J].J Pesticide Sci,1987,3:411-417.
[7]　李克斌.土壤腐殖酸的提取及表征[J].陜西化工,1998,27(4):11-13.
Li Kebin.Extraction and characterization of humic acid in soil[J].Shanxi Chemical Industry,1998,27(4):11-13.
[8]　Senesi N,Dorazio V,Ricca G.Humic acids in the first generation of Eurosoils[J].Geodema,2003,116:325-344.
[9]　Mansuy Laurence.Characterization of humic substances in highly polluted river sediments by pyrolysis methylation_gas chromatography_mass spectrometry[J].Organic Geochemistry,2001,32:223-231.
[10]　Reveille Veronique.Characterization of sewage sludge_derived organic matter:lipids andHAs [J].Organic Geochemistry,2003,34:615-627.

---

收稿日期:2004-08-12
基金項目:國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目(2003CB415007);國家重點
基金研究發(fā)展計劃前期研究項目(2001CCB00700)
作者簡介:譚文捷(1980-),女,山東煙臺人,碩士研究生.
*通訊聯(lián)系人